书 书 书犐犆犛 ６７ ． ０４０ 犅 ２０ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ５５２１ — ２００８ 代替 ＧＢ ／ Ｔ５５２１ — １９８９ 粮油检验 　 谷物及其制品中 α  淀粉酶 活性的测定 　 比色法 犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀狅犳犵狉犪犻狀犪狀犱狅犻犾狊 — 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犪犾狆犺犪犪犿狔犾犪狊犲 犪犮狋犻狏犻狋狔犻狀犮犲狉犲犪犾犪狀犱犮犲狉犲犪犾狆狉狅犱狌犮狋狊 — 犆狅犾狅狉犻犿犲狋狉犻犮犿犲狋犺狅犱 ２００８  １１  ０４ 发布 ２００９  ０１  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准是对 ＧＢ ／ Ｔ５５２１ — １９８９ 《 谷物和谷物产品 α  淀粉酶活性的测定 　 比色法 》 的修订 。 本标准代替 ＧＢ ／ Ｔ５５２１ — １９８９ 。 本标准与 ＧＢ ／ Ｔ５５２１ — １９８９ 相比主要变化如下 ： ——— 增加了规范性引用文件 ； ——— 对术语和定义进行了修改 ； ——— 增加了对测试报告的要求 ； ——— 将计算举例由正文调至附录 ， 作为资料性附录 。 本标准的附录 Ａ 为资料性附录 。 本标准由国家粮食局提出 。 本标准由全国粮油标准化技术委员会归口 。 本标准起草单位 ： 南京财经大学 。 本标准主要起草人 ： 鞠兴荣 、 王素雅 、 袁建 、 杨慧萍 。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ５５２１ — １９８５ 、 ＧＢ ／ Ｔ５５２１ — １９８９ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ５５２１ — ２００８ 粮油检验 　 谷物及其制品中 α  淀粉酶 活性的测定 　 比色法 １ 　 范围 本标准规定了比色法测定谷物及制品中 α  淀粉酶活性的术语和定义 、 原理 、 试剂和材料 、 仪器 、 操 作步骤 、 结果计算 、 精密度和测试报告 。 本标准适用于测定谷物和谷物产品 α  淀粉酶活性 ， 也可用于测定源于真菌和细菌的 α  淀粉酶干粉 的活性 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本部分达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 （ ＧＢ ／ Ｔ６６８２ — ２００８ ， ＩＳＯ３６９６ ： １９８７ ， ＭＯＤ ） ３ 　 术语和定义 下列术语与定义适用于本标准 。 ３ ． １ 　　 β  极限糊精 　 β 犾犻犿犻狋犱犲狓狋狉犻狀狊 能被 β  淀粉酶完全降解的淀粉产物 。 ３ ． ２ 　　 酶活力单位 　 犲狀狕狔犿犻犮犪犮狋犻狏犻狋狔 １Ｌ 溶剂从 １ｇ 样品中所提取的酶 ， 在规定条件下 ， 每秒钟降解 １．０２４×１０ －５ 单位的 β  极限糊精底 物溶液 ， 该样品的 α  淀粉酶活力为 １ 个单位 。 ４ 　 原理 α  淀粉酶降解 β  极限糊精底物溶液 ， 在酶促反应进程中 ， 分别在不同时间将反应混合物等分加到碘 溶液中 。 随着反应时间的延长 ， 反应混合物与碘液的显色强度降低 ， 以测定酶活性 。 ５ 　 试剂和材料 除非另有说明 ， 所用试剂均为分析纯 。 实验用水符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中三级水的要求 。 ５ ． １ 　 碘 。 ５ ． ２ 　 碘化钾 。 ５ ． ３ 　 氯化钙 。 ５ ． ４ 　 无水乙酸钠 。 ５ ． ５ 　 硫酸 。 ５ ． ６ 　 冰乙酸 。 ５ ． ７ 　 可溶性淀粉 。 注 ： 可采用 Ｌｉｎｔｎｅｒ 淀粉或质量相当的国产可溶性淀粉 。 １ 犌犅 ／ 犜 ５５２１ — ２００８ ５ ． ８ 　 浮石粉 。 ５ ． ９ 　 碘贮备液 ： 称取 １１．０ｇ 碘化钾溶于少量水中 ， 加 ５．５０ｇ 结晶碘 ， 搅拌至碘完全溶解 。 再定容至 ２５０ｍＬ ， 置于棕色瓶中 ， 在暗处贮存 ， 此溶液可保存一个月 。 ５ ． １０ 　 碘稀释液 ： 称取 ４０．０ｇ 碘化钾溶于水中 ， 加 ４．００ｍＬ 碘贮备液 ， 并稀释至 １Ｌ ， 用时现配 ， 不可 过夜 。 ５ ． １１ 　 硫酸溶液 ： 犮 （ Ｈ ２ ＳＯ ４ ） ＝０．０５ｍｏｌ ／ Ｌ 。 ５ ． １２ 　 缓冲液 ： 称取 １６４ｇ 无水乙酸钠溶于水中 ， 加入 １２０ｍＬ 冰乙酸 ， 用水定容至 １Ｌ 。 ５ ． １３ 　 氯化钙溶液 ： 犮 （ ＣａＣｌ ２ ） ＝０．２％ 。 ５ ． １４ 　 β  淀粉酶溶液 ： 称取 １０ｇ 有酶活性的黄豆粉 （ 粗细度为通过 １．５ｍｍ 孔筛 ）， 加入 ８５ｍＬ 水和 １５ｍＬ０．０５ｍｏｌ ／ Ｌ 硫酸 （ ５．１１ ） 充分搅匀 ， 静置 １５ｍｉｎ ， 抽滤 ， 该滤液即为 β  淀粉酶溶液 。 ５ ． １５ 　 β  极限糊精溶液 ： 称取 ５．００ｇ （ 干基 ） 可溶性淀粉于小烧杯中 ， 加入约 ２０ｍＬ 水混匀 ， 将其边搅拌 边缓慢倒入盛有 １００ｍＬ 沸水的 ５００ｍＬ 高型烧杯 （ ６．６ ） 中 ， 并用洗瓶将小烧杯中的淀粉全部转移至高 型烧杯中 ， 继续搅拌并加热 ， 缓慢煮沸 ２ｍｉｎ 。 加盖表面皿 ， 在自来水中冷却至 ３０℃ 以下 ， 加入 ２５ｍＬ 缓冲溶液 （ ５．１２ ） 及 ５０ｍＬ β  淀粉酶溶液 （ ５．１４ ）， 在室温下放置 ２０ｈ ， 加入 １ 勺浮石粉 ， 将此溶液在 １０ｍｉｎ 之内缓慢煮沸 ， 然后继续沸腾 ５ｍｉｎ 以上 。 冷却至 ３０℃ 以下 ， 用水定容至 ２５０ｍＬ ， 摇匀 ， 过滤 。 滤液中加几滴甲苯 ， 此溶液的 ｐＨ 值应为 （ ４．７±０．１ ）， 在 ２５℃ 以下可连续使用 ５ 天 。 ６ 　 仪器 ６ ． １ 　 恒温水浴 ： ３０℃±０．１℃ 与 ２０℃±０．１℃ 各 １ 台 。 ６ ． ２ 　 分光光度计或比色计 。 ６ ． ３ 　 秒表 。 ６ ． ４ 　 筛 ： 孔径为 １．０ｍｍ 、 １．５ｍｍ 。 ６ ． ５ 　 ｐＨ 计 。 ６ ． ６ 　 烧杯及高型烧杯 ： １００ｍＬ 、 ２５０ｍＬ 、 ５００ｍＬ 。 ６ ． ７ 　 容量瓶 ： ２５０ｍＬ 、 １０００ｍＬ 。 ６ ． ８ 　 锥形瓶 ： ３００ｍＬ 。 ６ ． ９ 　 移液管 ： ５ｍＬ 、 ２０ｍＬ 。 ６ ． １０ 　 分析天平 ： 分度值 ０．０１ｇ 。 ７ 　 操作步骤 ７ ． １ 　 分光光度计及其空白调整 将分光光度计 （ ６．２ ） 连接稳压电源 ， 预热 ２０ｍｉｎ ， 调整波长为 ５７５ｎｍ 。 将 ２．０ｍＬ 氯化钙溶液 （ ５．１３ ） 加到 １０．０ｍＬ 碘稀释液 （ ５．１０ ） 中 ， 然后以适量的水 （ 犞 ０ ） 稀释 （ 加水量一般为 ２０ｍＬ ～ ４０ｍＬ ， 犞 ０ 详见 ７．２ ）， 混匀后置于 ２０℃ 水浴中 ， 用 １ｃｍ 比色皿进行测试 ， 调节仪器狭缝宽度 ， 使吸光度为零 。 ７ ． ２ 　 底物溶液的校准 分别吸取 ５．０ｍＬ β  极限糊精溶液 （ ５．１５ ） 和 １５．０ｍＬ 氯化钙溶液 （ ５．１３ ） 于一个 １００ｍＬ 烧杯 （ ６．６ ） 中 ， 混匀 。 取出 ２．０ｍＬ 混合液至另一个 １００ｍＬ 烧杯 （ ６．６ ） 中 ， 加入 １０．０ｍＬ 碘稀释液 （ ５．１０ ） 和适量的 水 ， 混匀后置于 ２０℃ 水浴中 ， 用 １ｃｍ 比色皿在波长 ５７５ｎｍ 处 ， 以 ７．１ 所用溶液为参比 ， 测其吸光度 。 调整加水量 ， 使测得的吸光度在 ０．５５ ～ ０．６０ 之间 ， 如果测得吸光度大于 ０．６０ 则增大加水量 ， 如果测得 值少于 ０．５５ 则减少加水量 。 通过反复试配 ， 直至测定的吸光度值在 ０．５５ ～ ０．６０ 之间 ， 记下此时的加水 量 （ 犞 ０ ）， 并用它调整空白溶液的加水量 ， 犞 ０ 即为该 β  极限糊精测试时的加水量 。 ７ ． ３ 　 提取 称取谷物样品约 ５ｇ （ 精确到 ０．０５ｇ ）， 倒入 ３００ｍＬ 锥形瓶中 ， 加入预热到 ３０℃ 的氯化钙溶液 ２ 犌犅 ／ 犜 ５５２１ — ２００８ （ ５．１３ ） １００ｍＬ±０．５ｍＬ ， 充分摇匀 ， 置于 ３０℃ 的恒温水浴中 。 在 １５ｍｉｎ 、 ３０ｍｉｎ 、 ４５ｍｉｎ 时从水浴中取 出 ， 上下颠倒锥形瓶 （ ６．８ ） １０ 次 ， 重新置于水浴 ， 共提取 ６０ｍｉｎ 。 取出锥形瓶并过滤 ， 滤液即为 α  淀粉酶 的提取液 。 ７ ． ４ 　 活性测定 将 α  淀粉酶提取液和 β  极限糊精溶液置于 ３０℃ 水浴中预热 ， １０ｍｉｎ 后用快速移液管吸移 ５．０ｍＬ β  极限糊精溶液 （ ５．１５ ） 至盛有 １５．０ｍＬ 酶提取液 （ ７．３ ） 的锥形瓶中 ， 加塞后摇匀 。 在加液的同时 ， 用秒 表计时 。 吸取 １０．０ｍＬ 稀碘溶液 （ ５．１０ ） 于各个 ５０ｍＬ 容量瓶 （ ６．７ ） 中 ， 加入 犞 ０ ｍＬ 水 （ ７．２ ）， 混匀加塞 后置于 ２０℃ 水浴中 ， 每隔 ５ｍｉｎ 或 １０ｍｉｎ 进行下列操作 ： ａ ） 　 吸取 ２．０ｍＬ 酶 、 β  极限糊精混合液 （ ７．４ ） 到一个盛