书 书 书犐犆犛 ０７ ． ０８０ 犅 ２０ ／ ３９ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３４２２２ — ２０１７ /G21 /G22 /G21 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳狉犻犫狅狀狌犮犾犲犪狊犲 ２０１７  ０９  ０７ /G2B /G2C ２０１８  ０４  ０１ /G2D /G2E /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G2F /G31 /G32 /G33 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G34 /G35 /G36 /G37 /G38 /G39 /G2B /G2C书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由中国标准化研究院提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中国标准化研究院 、 厦门市格灵生物技术有限公司 、 福建赛福食品检测研究所有限公司 、 浙江工商大学 、 河北农业大学 、 合肥工业大学 、 河北省出入境检验检疫局 、 泉州市标准化研究所 、 北京市食品科学研究院 、 河北食品检验研究院 、 东营市标准化信息所 、 河南大学 。 本标准主要起草人 ： 马爱进 、 陈智勇 、 黄秀娟 、 王彦波 、 孙纪录 、 郑磊 、 刘道亮 、 林清山 、 孙勇 、 云振宇 、 傅玲琳 、 吴琦 、 赵琳 、 周魏 、 刘鹏 、 康文艺 、 宗学花 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３４２２２ — ２０１７ 核糖核酸酶活力检测方法 １ 　 范围 本标准规定了核糖核酸酶活力检测原理 、 仪器设备及器具 、 主要试剂 、 分析步骤和结果分析 。 本标准适用于生化试剂核糖核酸酶活力检测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３ ． １ 核糖核酸酶 　 狉犻犫狅狀狌犮犾犲犪狊犲 ； 犚犖犪狊犲 水解核糖核酸 （ ＲＮＡ ） 中磷酸二酯键 ， 生成寡核苷酸或单核苷酸的核酸酶 。 ３ ． ２ 核糖核酸酶活力单位 　 狉犻犫狅狀狌犮犾犲犪狊犲犪犮狋犻狏犻狋狔狌狀犻狋 以浓度为 ０．１５ｍｇ ／ ｍＬ 的 １．５ｍＬ 酵母 ＲＮＡ 为底物 ， 在 ５０℃ 且 ｐＨ５．０ 的条件下 ， １ｍｉｎ 内使反应液在 ２６０ｎｍ 处吸光度增加 ０．００１ 所需要的酶量 。 注 ： 一个酶活力单位以 Ｕ 表示 。 ４ 　 原理 核糖核酸酶催化核糖核酸分解 ， 降解产物在 ２６０ｎｍ 波长下具有特征吸收峰 ， 通过外标法计算核糖核酸酶的酶活力 。 ５ 　 仪器设备及器具 ５ ． １ 　 恒温水浴槽 ： 精度为 ０．１℃ 。 ５ ． ２ 　 紫外  可见分光光度计 ： 精度为 ０．００１ 。 ５ ． ３ 　 ｐＨ 计 ： 精度为 ０．０１ 。 ５ ． ４ 　 １ｃｍ 石英比色皿 。 ５ ． ５ 　 电子天平 ： 精度为 ０．０００１ｇ 、 ０．０１ｇ 或 ０．１ｇ 。 ６ 　 试剂 本方法所用试剂均为分析纯 ， 除特殊说明外 ， 实验用水均为 ＧＢ ／ Ｔ６８８２ 规定的二级水 。 １ 犌犅 ／ 犜 ３４２２２ — ２０１７ ６ ． １ 　 ０ ． １ 犿狅犾 ／ 犔 乙酸钠 ／ 乙酸 （ 犆犎 ３ 犆犗犗犖犪 ／ 犆犎 ３ 犆犗犗犎 ， 犖犪犃犮 ／ 犎犃犮 ） 缓冲液 ， 狆犎 ５ ． ０ 称取 ８．２ｇＮａＡｃ ， 精确至 ０．０１ｇ ， 溶于水中 ， 缓慢加入 ＨＡｃ 调 ｐＨ 至 ５．０ ， 混匀后定容至 １０００ｍＬ 。 ６ ． ２ 　 酵母核糖核酸 来源于圆酵母 ， 含量 ≥ ９８％ 。 ７ 　 分析步骤 ７ ． １ 　 环境要求 所有试验操作应在洁净的无外源 ＲＮＡ 酶环境中进行 。 ７ ． ２ 　 试验液的制备 ７ ． ２ ． １ 　 酵母 犚犖犃 溶液 称取酵母 ＲＮＡ０．０１５ｇ ， 精确至 ０．０００１ｇ ， 溶于水中 ， 使其溶液浓度为 ０．１５ｍｇ ／ ｍＬ 。 ７ ． ２ ． ２ 　 固体样品待测酶液制备 根据标称 ， 称取固体待测样品适量 ， 溶于水中 ， 调节核糖核酸酶活力在 １０Ｕ ／ ｍｇ ～ ２００Ｕ ／ ｍｇ 。 ７ ． ２ ． ３ 　 液体样品待测酶液制备 根据标称 ， 用水调节待测液体样品的核糖核酸酶活力在 １０Ｕ ／ ｍＬ ～ ２００Ｕ ／ ｍＬ 。 ７ ． ３ 　 酶促反应 同一样本取 ４ 只离心管 ， 设置空白对照管 １ 只 ， 检测管 ３ 只 ， 其中空白管中依次加入酵母 ＲＮＡ 溶 液 １．５ｍＬ 、 水 ０．５ｍＬ 与 ＮａＡｃ ／ ＨＡｃ 缓冲液 １．０ｍＬ ； 检测管中依次加入酵母核糖核酸 （ ＲＮＡ ） 溶液 １．５ｍＬ 、 待测酶液 ０．５ｍＬ 以及 ＮａＡｃ ／ ＨＡｃ 缓冲液 １．０ｍＬ 。 每个待测酶液设定三个重复即 ３ 个检测 管 ， ５０℃±１℃ 恒温水浴反应时间为 １５ｍｉｎ 。 ７ ． ４ 　 分光光度分析 空白对照管标记为 ０ 号管 ， 检测管分别标记为 １ 号管 ～ ３ 号管 ， 加样方法如表 １ 所示 ， 反应后在 ２６０ｎｍ 处测对照管和检测管溶液的吸光度 ， 并记录结果 。 表 １ 　 待测样液加样方法 试剂 ０ 号管 １ 号管 ２ 号管 ３ 号管 酵母核糖核酸溶液 ／ ｍＬ １．５ １．５ １．５ １．５ 水 ／ ｍＬ ０．５ ０．０ ０．０ ０．０ ＮａＡｃ ／ ＨＡｃ 缓冲液 ／ ｍＬ １．０ １．０ １．０ １．０ 待测酶液 ／ ｍＬ ０．０ ０．５ ０．５ ０．５ ２ 犌犅 ／ 犜 ３４２２２ — ２０１７ ８ 　 结果分析 ８ ． １ 　 酶活力计算 按照式 （ １ ） 计算 ： 犆 ＝ Δ 犃 ２６０ × １０００ × 稀释倍数 １５ …………………………（ １ ） 　　 式中 ： 犆 　 ——— 核糖核酸酶活力 （ Ｕ ／ ｍＬ 或 Ｕ ／ ｍｇ ）； Δ 犃 ２６０ ——— 检测管与空白对照管在 ２６０ｎｍ 处测定得到的吸收值差 ； １０００ ——— 吸光度原值与活力规定中规定吸光度 ０．００１ 的换算系数 ； １５ ——— 反应时间与活力单位定义中的换算系数 。 以平行样的平均值为最终的酶活力测定值 ， 计算结果保留整数位 。 ８ ． ２ 　 定量限 本方法的定量限为 １０Ｕ ／ ｍＬ 或 １０Ｕ ／ ｍｇ 。 ８ ． ３ 　 重复性 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 １０％ 。 犌犅 ／ 犜 ３４２２２ — ２０１７