书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ３０ 犅 ４１ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ３６１９０ — ２０１８ 草鱼出血病诊断规程 犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳犱犻犪犵狀狅狊狋犻犮犿犲狋犺狅犱狊犳狅狉犺犲犿狅狉狉犺犪犵犻犮犱犻狊犲犪狊犲狅犳犵狉犪狊狊犮犪狉狆 ２０１８  ０５  １４ 发布 ２０１８  １２  ０１ 实施 国家市场监督管理总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出 。 本标准由全国水产标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１５６ ） 归口 。 本标准起草单位 ： 浙江省淡水水产研究所 、 中国检验检疫科学研究院 、 深圳出入境检验检疫局 。 本标准主要起草人 ： 沈锦玉 、 潘晓艺 、 郝贵杰 、 徐洋 、 江育林 、 陈爱平 、 高隆英 、 袁雪梅 、 尹文林 、 姚嘉 /G21 、 蔺凌云 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３６１９０ — ２０１８ 草鱼出血病诊断规程 １ 　 范围 本标准规定了草鱼出血病诊断的临床症状 、 采样 、 病毒分离和鉴定以及综合判定 。 本标准适用于草鱼出血病的流行病学调查 、 诊断 、 检疫和监测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ ／ Ｔ１８０８８ 　 出入境动物检疫采样 ＳＣ ／ Ｔ７０１６．３ 　 鱼类细胞系 　 第 ３ 部分 ： 草鱼卵巢细胞系 （ ＣＯ ） ＳＣ ／ Ｔ７１０３ 　 水生动物产地检疫采样技术规范 ３ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＡＭＶ ： 鸟类成髓细胞性白血病病毒 （ ａｖｉａｎｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓｖｉｒｕｓ ） ｂｐ ： 碱基对 （ ｂａｓｅｐａｉｒ ） ｃＤＮＡ ： 互补脱氧核糖核酸 （ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ） ＣＯ ： 草鱼卵巢细胞系 （ ｇｒａｓｓｃａｒｐｏｖａｒｙｃｅｌｌｌｉｎｅ ） ＣＰＥ ： 细胞病变效应 （ ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆｆｅｃｔ ） ＣＴＡＢ ： 十六烷基三甲基溴化铵 （ ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ ） ｄＮＴＰ ： 脱氧核糖核苷三磷酸 （ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＡＴＰ ： 脱氧腺苷三磷酸 （ ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＣＴＰ ： 脱氧胞苷三磷酸 （ ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＧＴＰ ： 脱氧鸟苷三磷酸三钠 （ ｄｅｏｘｙａｇｕａｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＴＴＰ ： 脱氧胸苷三磷酸 （ ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ＥＢ ： 溴化乙啶 （ ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ ） ＥＤＴＡ ： 乙二胺四乙酸 （ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ ） ＥＬＩＳＡ ： 酶联免疫吸附试验 （ ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ ） ＦＢＳ ： 胎牛血清 （ ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ ） ＧＣＲＶ ： 草鱼呼肠孤病毒 （ ｇｒａｓｓｃａｒｐｒｅｏｖｉｒｕｓ ） ＨＥＰＥＳ ： ４ 羟乙基哌嗪乙磺酸 ［ ４ （ ２ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ） １ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ ］ ＨＲＰ ： 辣根过氧化物酶 （ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ） ＭＣＰ ： 主要衣壳蛋白 （ ｍａｊｏｒｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎ ） ＰＢＳＴ ： 磷酸盐吐温缓冲液 （ ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎｔｗｅｅｎ２０ ） ＲＴＰＣＲ ： 逆转录  聚合酶链式反应 （ ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ） １ 犌犅 ／ 犜 ３６１９０ — ２０１８ ＲＮＡ ： 核糖核酸 （ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ） ＳＤＳＰＡＧＥ ： 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ） ＴＢＥ ： 三羟甲基氨基甲烷硼酸乙二胺四乙酸缓冲液 （ ＴｒｉｓＢｏｒａｔｅＥＤＴＡ ） ４ 　 试剂和材料 ４ ． １ 　 琼脂糖 ： 电泳级 。 ４ ． ２ 　 邻苯二胺 ： 分析纯 。 ４ ． ３ 　 ＡＭＶ 逆转录酶 ： １０Ｕ ／ μ Ｌ ， －２０℃ 保存 ， 避免反复冻融或温度剧烈变化 。 ４ ． ４ 　 ＲＮＡ 酶抑制剂 （ ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ ）： －２０℃ 保存 ， 避免反复冻融或温度剧烈变化 。 ４ ． ５ 　 ｄＮＴＰ ： 含 ｄＣＴＰ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＡＴＰ 、 ｄＴＴＰ 各 １０ｍｍｏｌ ／ Ｌ ， －２０℃ 保存 。 ４ ． ６ 　 犜犪狇 酶 ： １０Ｕ ／ μ Ｌ ， 保存温度为 －２０℃ ， 同时应避免反复冻融或温度剧烈变化 。 ４ ． ７ 　 无水乙醇 ： 分析纯 ， 使用前预冷到 －２０℃ 。 ４ ． ８ 　 ＤＮＡ 分子量标准 ： ＤＮＡＭａｒｋｅｒ２０００ ， ４℃ 保存 。 ４ ． ９ 　 辣根过氧化物酶 （ ＨＲＰ ） 标记的抗鼠抗体 ： －２０℃ 保存 。 ４ ． １０ 　 过氧化氢 ： 分析纯 。 ４ ． １１ 　 ＧＣＲＶ 参考株 ： ＧＣＲＶ８７３ 株 （ ＧＣＲＶ Ⅰ 型 ）、 ＧＣＲＶ９０１４ 株 （ ＧＣＲＶ Ⅱ 型 ）、 ＧＣＲＶＨＢ１００７ 株 （ ＧＣＲＶ Ⅲ 型 ）。 注 ： 由农业部相关部门指定机构提供 。 ４ ． １２ 　 羊抗 ＧＣＲＶ 免疫球蛋白 ： －２０℃ 保存 。 注 ： 由动物防疫管理部门指定单位提供 。 ４ ． １３ 　 鼠抗 ＧＣＲＶ 单克隆抗体 ： －２０℃ 保存 。 注 ： 由动物防疫管理部门指定单位提供 。 ４ ． １４ 　 鱼类细胞系 ： ＣＯ 应符合 ＳＣ ／ Ｔ７０１６．３ 的规定 。 ４ ． １５ 　 水 ： ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中一级水 ， 核酸抽提和 ＲＴＰＣＲ 须使用无 ＲＮＡ 酶的去离子水 。 ４ ． １６ 　 鱼类细胞培养液 ： 用含厄尔平衡盐 （ Ｅａｒｌｅｓｂａｌａｎｃｅｄｓａｌｔｓ ） 的 Ｍ１９９ 培养基配制 （ 见附录 Ａ 中 Ａ．１ ）， 或其他商品化的细胞培养基 ， 另加 １０％ 胎牛血清 （ ＦＢＳ ）。 ４ ． １７ 　 鱼类细胞维持液 ： 用含厄尔平衡盐 （ Ｅａｒｌｅｓｂａｌａｎｃｅｄｓａｌｔｓ ） 的 Ｍ１９９ 培养基配制 ， 另加 ２％ 胎牛血清 （ ＦＢＳ ）。 ４ ． １８ 　 细胞消化液 ： 见 Ａ．２ 。 ４ ． １９ 　 ＡＭＶ 逆转录酶缓冲液和 犜犪狇 酶缓冲液 ： 分别见 Ａ．６ 、 Ａ．７ 。 ４ ． ２０ 　 电泳缓冲液 ： ＴＢＥ 电泳缓冲液 （ ５ 倍浓缩液 ， 见 Ａ．８ ）。 ４ ． ２１ 　 ＭｇＣｌ ２ ： ２５ｍｍｏｌ ／ Ｌ ， 保存温度为 －２０℃ 。 ４ ． ２２ 　 包被稀释液 ： 为 ０．０５ｍｏｌ ／ Ｌ 、 ｐＨ＝９．６ 的碳酸盐缓冲液 （ 见 Ａ．１１ ）。 ４ ． ２３ 　 封闭液 ： １％ 明胶 （ 用包被稀释液配制 ）。 ４ ． ２４ 　 终止液 ： ２ｍｏｌ ／ Ｌ 的硫酸 。 ４ ． ２５ 　 依据 ＧＣＲＶＩ 型中 Ｓ１０ 片段序列设计引物 ， 扩增 Ｓ１０ 中的 ６９８ｂｐ 片段 （ 见附录 Ｂ 中 Ｂ．１ ）： １０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ 正向引物 ： ５′ＣＣＣＣＧＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＣＧＡＴ３′ ； １０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ 反向引物 ： ５′ＣＧＣＧＴＴＣＧＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＧ３′ 。 ４ ． ２６ 　 依据 ＧＣＲＶＩＩ 型的 Ｍ６ 片段序列设计引物 ， 扩增 Ｍ６ 中的 ３２０ｂｐ 片段 （ 见 Ｂ．２ ）： １０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ 正向引物 ： ５′ＡＧＴＴＣＴＣＡＡＡＧＣＴＧＡＧＡＣＡＧ３′ ； １０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ 反向引物 ： ５′ＡＣＧＴＧＣＧＡＴＴＧＧＡＡＧＡＧＣＴＴ３′ 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３６１９０ — ２０１８ ４ ． ２７ 　 依据 ＧＣＲＶＩＩＩ 型的 Ｌ２ 片段序列设计引物 ， 扩增 Ｌ２ 中的 ４７４ｂｐ 片段 （ 见 Ｂ．３ ）： １０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ 正向引物 ： ５′ＧＴＡＡＧＣＣＣＡＣＡＧＧＴＣＣＣＡＣＴ３′ ； １０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ 反向引物 ： ５′ＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＡＧＧＡＡＴＡＧＣＡＧＴ３′ 。 ５ 　 器材和设备 ５ ． １ 　 倒置显微镜 。 ５ ． ２ 　 生化培养箱 。 ５ ． ３ 　 普通冰箱和超低温冰箱 。 ５ ． ４ 　 组织研磨器 。 ５ ． ５ 　 冷冻离心机 。 ５ ． ６ 　 生物安全柜或超净工作台 。 ５ ． ７ 　 ＰＣＲ 仪 。 ５ ． ８ 　 电泳仪 、 水平电泳槽和垂直电泳槽 。 ５ ． ９ 　 微量移液器 。 ５ ． １０ 　 凝胶成像仪或紫外