书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ０１ 犆犆犛犅 １６ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ４０４５７ — ２０２１ 咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法 犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳 犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犽犪犺犪狑犪犲 犑．犕．犠犪犾犾犲狉牔犅狉犻犱犵犲 ２０２１  ０８  ２０ 发布 ２０２２  ０３  ０１ 实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本文件按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２０２０ 《 标准化工作导则 　 第 １ 部分 ： 标准化文件的结构和起草规则 》 的规定起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由全国植物检疫标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２７１ ） 提出并归口 。 本文件起草单位 ： 宁波检验检疫科学技术研究院 、 中国科学院微生物研究所 、 中华人民共和国天津海关 。 本文件主要起草人 ： 段维军 、 蔡磊 、 刘芳 、 李雪莲 、 张慧丽 、 赵鹏 、 廖芳 、 陈先锋 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ４０４５７ — ２０２１ 咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法 １ 　 范围 　　 本文件描述了咖啡浆果炭疽病菌形态学和分子生物学特征的鉴定检测方法 。 本文件适用于携带咖啡浆果炭疽病菌的植物及其产品中咖啡浆果炭疽病菌的检测 。 ２ 　 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件 。 ３ 　 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 ４ 　 分类信息 中文名 ： 咖啡浆果炭疽病菌学名 ： 犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犽犪犺犪狑犪犲 Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｌｅｒ＆Ｂｒｉｄｇｅ 分类地位 ： 真菌界 （ Ｆｕｎｇｉ ）， 子囊菌门 （ Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ ）， 盘菌亚门 （ Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ ）， 粪壳菌纲 （ Ｓｏｒｄａｒｉｏｍｙｃｅｔｅｓ ）， 肉座菌亚纲 （ Ｈｙｐｏｃｒｅｏｍｙｃｅｔｉｄａｅ ）， 小丛壳目 （ Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａｌｅｓ ）， 小丛壳科 （ Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａｃｅａｅ ）， 刺盘孢属 （ 犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿 ）。 分布 、 寄主 、 传播途径等信息见附录 Ａ 。 ５ 　 鉴定原理 根据咖啡浆果炭疽病菌在寄主植物上的症状 ， 抽取可疑样品进行病原菌分离培养 ， 按照病原菌的形态特征和实时荧光 ＰＣＲ 特异性反应进行鉴定 。 ６ 　 仪器设备 、 器具 、 试剂和培养基 ６ ． １ 　 仪器设备和器具 高压灭菌锅 、 显微镜 、 解剖镜 、 天平 、 水浴锅 、 纯水仪 、 涡旋振荡器 、 高速冷冻离心机 、 冰箱 、 生化培养箱 、 实时荧光 ＰＣＲ 仪 、 紫外分光光度计 、 微量移液器 （ ０．１ μ Ｌ ～ ２．５ μ Ｌ 、 １ μ Ｌ ～ １０ μ Ｌ 、 １０ μ Ｌ ～ ５０ μ Ｌ 、 ２０ μ Ｌ ～ ２００ μ Ｌ 、 １００ μ Ｌ ～ １０００ μ Ｌ ）、 研钵 、 锥形瓶 、 培养皿 、 载玻片 、 盖玻片 、 灭菌滤纸 。 ６ ． ２ 　 试剂 十六烷基三甲基溴化铵 （ ＣＴＡＢ ） 提取液 （ ２％ＣＴＡＢ ， １．４ｍｏｌ ／ ＬＮａＣｌ ， ２０ｍｍｏｌ ／ ＬＥＤＴＡ ， １００ｍｍｏｌ ／ ＬＴｒｉｓ · ＨＣｌｐＨ８．０ ）、 三羟甲基氨基甲烷 （ Ｔｒｉｓ ） 饱和酚 、 三氯甲烷 、 异戊醇 、 异丙醇 、 ７５％ 乙醇 、 ＲＮＡ 酶 、 超纯水 、 实时荧光聚合酶链式反应 （ ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ ） 反应预混液 ： ２× 犜犪狇 ＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌ １ 犌犅 ／ 犜 ４０４５７ — ２０２１ ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ （ 宜使用 ， 亦可自行配制 ）。 除另有规定外 ， 所有试剂均为分析纯或生化试剂 。 ６ ． ３ 　 培养基 麦芽汁培养基 （ ＭＥＡ ）： 麦芽汁 ２０ｇ ， 蛋白胨 ３ｇ ， 琼脂 ２０ｇ ， 加蒸馏水配制 １Ｌ 。 配成溶液后 １２１℃ 下灭菌 ２０ｍｉｎ 。 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 （ ＰＤＡ ）： 马铃薯 ２００ｇ ， 葡萄糖 ２０ｇ ， 琼脂粉 ２０ｇ ， 加蒸馏水配制 １Ｌ 。 配成溶液后 １２１℃ 下灭菌 ２０ｍｉｎ 。 ７ 　 检疫鉴定 ７ ． １ 　 分离培养 切取发病材料病健交界处的植物组织 （ 约 ０．３ｃｍ×０．３ｃｍ ）， 用 ７５％ 乙醇浸泡 １ｍｉｎ 进行表面消毒 ， 无菌水冲洗 ３ 次后置于灭菌滤纸上 ， 吸干水分后放置于倒有麦芽汁培养基 （ ＭＥＡ ） 的培养皿中 。 培养皿放置在温度为 ２５℃ 条件下光照培养箱中培养 （ 光照和黑暗各 １２ｈ 交替 ）。 培养 ４ｄ ～ ６ｄ 后 ， 挑取可疑菌落边缘的菌丝进行纯化培养 。 ７ ． ２ 　 形态学观察 显微镜观察孢子的形态特征 、 产孢方式 。 观察记录菌落的直径 、 颜色 、 分生孢子和附着胞的形成情况等 （ 见图 Ａ．２ ）。 ７ ． ３ 　 犇犖犃 制备 ＤＮＡ 制备按照附录 Ｂ 的方法提取 。 ７ ． ４ 　 犇犖犃 纯度与浓度的测定 用紫外分光光度计测定 ＤＮＡ 的纯度与浓度 ， 分别读取 ２６０ｎｍ 和 ２８０ｎｍ 处的吸收值 ， 计为 ＯＤ ２６０ 、 ＯＤ ２８０ 。 ＤＮＡ 的纯度 ＯＤ ２６０ ／ ＯＤ ２８０ 比值应为 １．７ ～ １．９ ， ＤＮＡ 的浓度为 ５０ 倍的 ＯＤ ２６０ （ μ ｇ ／ ｍＬ ）。 ＤＮＡ 的浓度与纯度应符合实时荧光聚合酶链式反应 （ ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ ） 检测的要求 。 ７ ． ５ 　 实时荧光 犘犆犚 检测 实时荧光聚合酶链式反应 （ ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ ） 方法按照附录 Ｃ 的方法检测 。 ８ 　 鉴定特征 ８ ． １ 　 症状 该病害可以发生在咖啡树生长的所有阶段 ， 主要危害咖啡浆果 ， 造成果实脱落 ， 偶尔侵染叶片 。 浆果表面初时呈现近圆形水渍状小斑点 ， 后病斑变成凹陷 ， 暗褐色至灰黑色大病斑 ， 其上长出粉红色黏液状物 。 病叶上可见褐色炭疽状病斑 ， 其上有许多黑色小点 （ 病原菌的分生孢子 ） 排列成同心轮纹 （ 见图 Ａ．１ ）。 ８ ． ２ 　 鉴定特征 在温度为 ２５℃ 下 ， 咖啡浆果炭疽菌培养物在 ２％ 麦芽汁培养基 （ ＭＥＡ ） 平板上生长 ７ｄ 后 ， 菌落直 ２ 犌犅 ／ 犜 ４０４５７ — ２０２１ 径可达 １４ｍｍ ～ ２８ｍｍ ， 正面灰色至深橄榄灰色 ， 背面深绿色 。 继代培养的菌落的颜色发生变化 ， 多为灰白色或棕色 。 分生孢子着生于菌丝上 ， 直立 ， 圆柱形 ， 无分隔 ， 两端钝圆 ，（ １２．５ μ ｍ ～ １９ μ ｍ ） × （ ４ μ ｍ ～ ５ μ ｍ ）。 附着胞浅褐色至褐色 ， 圆形或不规则 ，（ ８ μ ｍ ～ ９．５ μ ｍ ） × （ ５．５ μ ｍ ～ ６．５ μ ｍ ）（ 见图 Ａ．２ ）。 ８ ． ３ 　 实时荧光 犘犆犚 鉴定 在阴性对照 、 空白对照正常的情况 ， 则有如下判定 ： ——— 样品无 Ｃｔ 值并且无扩增曲线 ， 判定为阴性 ； ——— 样品 Ｃｔ 值 ≤ ３５．０ ， 且出现典型的扩增曲线 ， 判定为阳性 ； ——— 样品 Ｃｔ 值在 ３５．０ ～ ４０．０ 之间时 ， 应重新提取样品 ＤＮＡ 进行扩增检测 。 重做 Ｃｔ 值大于 ４０ ， 判为阴性 ； 否则判为阳性 ； ——— 样品 Ｃｔ 值大于 ４０ 时 ， 判定为阴性 。 ９ 　 结果判定 若症状明显符合 ８．１ 鉴定特征 ， 且培养物培养特征符合 ８．２ 鉴定特征 ， 判定为检出咖啡浆果炭疽病菌 。 若症状不明显 ， 但培养物培养特征符合 ８．２ 鉴定特征 ， 且实时荧光 ＰＣＲ 检测结果为阳性 ， 判定为检出咖啡浆果炭疽病菌 。 １０ 　 样品保存 、 记录与复核 １０ ． １ 　 样品保存 、 记录 保存样品应置于 ２℃ ～ ８℃ 冰箱妥善保存 ， 对检出咖啡浆果炭疽病菌的样品应至少保存 ６ 个月 。 菌株保存于 ４℃ 冷藏箱 ， 核酸样品保存于 －２０℃ 或 －８０℃ 冰箱 。 以备复检 、 谈判和仲裁 。 分离到的咖啡浆果炭疽病菌应接种于马铃薯葡萄糖琼脂 （ ＰＤＡ ） 培养基中妥善保存 。 记录包括 ： 样品的来源 、 种类 、 采样时间 、 检测时间 、 地点 、 方法 、 结果等 ， 并有试验人员的签字 。 实时荧光 ＰＣＲ 要有检测阳性结果照片 。 １０ ． ２ 　 复核 由指定的单位或人员负责 ， 主要考察试验原始数据记录及实时荧光 ＰＣＲ 结果等资料的完整性和真实性 ， 必要时进行复核试验 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ４０４５７ — ２０２１ 附 　 录 　 犃 （ 资料性 ） 咖啡浆果炭疽病菌基本信息 犃 ． １ 　 地理分布 非洲 ： 安哥拉 、 布隆迪 、 喀麦隆 、 中非共和国 、 刚果 （ 金 ）、 埃塞俄比亚 、 肯尼亚 、 马拉维 、 莫桑比克 、 卢旺达 、 南非 、 坦桑尼亚 、 乌干达 、 赞比亚 、 津巴布韦 。 中美洲 ： 古巴 。 欧洲 ： 意大利 。 犃 ． ２ 　 寄主 咖啡 ， 包括小粒种 犆狅犳犳犲犪犪狉犪犫犻犮犪 、 中粒种 犆狅犳犳犲犪犮犪狀犲狆犺狅狉犪 和大粒种 犆狅犳犳犲犪犾犻犫犲狉犻犮犪 。 犃 ． ３ 　 传播途径 染病浆果为初侵染源 ， 也可借助人类耕作活动 、 鸟类 、 昆虫 、 雨水等进行传播 ， 远距离传播通过带病植株相关贸易进行传播 。 犃 ． ４ 　 危害情况 咖啡浆果炭疽病是一种毁