书 书 书犐犆犛 ６６ ． ０２０ ． ０１ 犆犆犛犅 １６ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ４０４５８ — ２０２１ 用于病原微生物高通量检测的核酸提取技术规范 犛狆犲犮犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狀狌犮犾犲犻犮犪犮犻犱犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀狌狊犲犱犳狅狉犺犻犵犺狋犺狉狅狌犵犺狆狌狋犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狆犪狋犺狅犵犲狀犻犮犿犻犮狉狅狅狉犵犪狀犻狊犿狊 　 ２０２１  ０８  ２０ 发布 ２０２２  ０３  ０１ 实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本文件按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２０２０ 《 标准化工作导则 　 第 １ 部分 ： 标准化文件的结构和起草规则 》 的规定起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由全国植物检疫标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２７１ ） 提出并归口 。 本文件起草单位 ： 中国检验检疫科学研究院 、 中山海关技术中心 。 本文件主要起草人 ： 姜帆 、 张永江 、 陈健 、 岳巧云 、 邱德义 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ４０４５８ — ２０２１ 用于病原微生物高通量检测的核酸提取技术规范 １ 　 范围 本文件规定了利用二代测序技术对病原微生物进行高通量检测的核酸的提取要求 ， 描述了对应的提取方法 。 本文件适用于植物及其产品的植物病原细菌 、 真菌 、 病毒和病媒生物携带的细菌的核酸提取方法 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。 其中 ， 注日期的引用文件 ， 仅该日期对应的版本适用于本文件 ； 不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ１９４８９ 　 实验室 　 生物安全通用要求 ＳＮ ／ Ｔ２７５２．４ 　 卫生检疫人员的自我防护规范 　 第 ４ 部分 ： 实验室人员 ＳＮ ／ Ｔ２７７６ 　 国境口岸医学媒介生物监测实验室管理要求 ＳＮ ／ Ｔ４２７８ — ２０１５ 　 国境口岸医学媒介昆虫 ＤＮＡ 条形码鉴定操作规程 ＳＮ ／ Ｔ４６２５ — ２０１６ 　 ＤＮＡ 条形码筛选与质量要求 ３ 　 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 ４ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＤＮＡ ： 脱氧核糖核酸 （ ＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ ） ＯＤ ： 光密度 （ ＯｐｔｉｃａｌＤｅｎｓｉｔｙ ） ＰＣＲ ： 聚合酶链式反应 （ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ ） ＲＮＡ ： 核糖核酸 （ ＲｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ ） ５ 　 总体要求 核酸提取主要包括生物样品的裂解和纯化两大步骤 。 裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程 ， 纯化则是使核酸与裂解体系中的其他成分 ， 如蛋白质 、 多糖 、 脂类等其他组织或者细胞成分彻底分离的过程 。 核酸提取应保证核酸一级结构的完整性 。 排除其他分子 ， 如蛋白质 、 多糖 、 脂类 、 有机溶剂等的污染 ， 保证下游高通量检测试验顺利进行 。 试验过程中应防止外界环境 （ 如灰尘 、 气溶胶 、 ＲＮＡ 酶等 ） 对核酸提取的污染 ， 以及病原物本身及试 １ 犌犅 ／ 犜 ４０４５８ — ２０２１ 验过程中的废弃物 、 废弃液等对环境的污染 。 在整个试验操作过程中应采用安全有效的防护措施 。 具体要求应符合 ＧＢ１９４８９ 、 ＳＮ ／ Ｔ２７５２．４ 、 ＳＮ ／ Ｔ２７７６ 中的规定 。 ６ 　 提取步骤 ６ ． １ 　 细胞裂解 从组织中提取核酸应先将组织分散成单个细胞 ， 然后破碎胞膜及核膜 ， 使核酸释放出来 。 从各种不同来源的样品中提取高纯度的病原微生物核酸 ， 因细胞结构及所含成分不同 ， 样品预处理的方式也不同 ， 植物及其产品 、 动物组织等宜采取液氮研磨的方式 。 ６ ． ２ 　 核酸的分离纯化 核酸样品中不应存在其他生物大分子 （ 如蛋白质 、 多糖 、 多酚和脂类等 ）， 以及不应存在对酶 （ 如核酸内切酶 、 ＤＮＡ 聚合酶等 ） 有抑制作用的成分 。 同时 ， 应排除其他核酸分子的污染 ， 例如 ， ＤＮＡ 样品中应去除污染的 ＲＮＡ ， 反之 ＲＮＡ 中应去除 ＤＮＡ 。 针对不同来源样品的具体核酸提取方法按附录 Ａ 和附录 Ｂ 的规定执行 。 ６ ． ３ 　 核酸质量检测 ６ ． ３ ． １ 　 核酸的完整性检测 将提取的核酸样品 （ ＤＮＡ 或 ＲＮＡ ） 进行琼脂糖凝胶电泳或芯片检测 ， 并与核酸分子量标准对照 。 完整性较好的 ＤＮＡ 样品呈现出明显而清晰的单一条带 ， 完整性较好的 ＲＮＡ 样品呈现出三条带 ， 亮度依次递减 。 ６ ． ３ ． ２ 　 核酸的浓度和纯度检测 利用仪器检测核酸的浓度及纯度 ： 核酸浓度可在仪器上直接读出 ， 核酸样品纯度用 ＯＤ ２６０ ／ ＯＤ ２８０ 值 检测 ， 纯度较高的 ＤＮＡＯＤ ２６０ ／ ＯＤ ２８０ 值应为 １．７ ～ １．９ ， ＲＮＡＯＤ ２６０ ／ ＯＤ ２８０ 值应为 １．８ ～ ２．０ 。 ６ ． ３ ． ３ 　 犘犆犚 法进一步检测核酸质量 宜采用 ＰＣＲ 法进一步检测核酸质量 ， 按照 ＳＮ ／ Ｔ４２７８ — ２０１５ 中的 ７．４ 执行 ， 扩增引物按照 ＳＮ ／ Ｔ４６２５ — ２０１６ 中的 ８ 章 、 ９ 章执行 。 出现目的片段的扩增产物可用于后续高通量检测 。 细菌 、 真菌高通量检测宜采用扩增子测序分析 ， 病毒高通量检测宜采用小 ＲＮＡ 测序分析 。 ７ 　 样品保存与记录 ７ ． １ 　 样品保存 提取出的核酸样品应先进行分装 ， 妥善保存在 －８０℃ 超低温冰箱中 ， 以保证其在后续分析中的稳定性 ， 避免反复冻融 。 ７ ． ２ 　 结果记录 应做好样品来源 、 取样人员 、 核酸浓度 、 核酸纯度 、 电泳结果图等文档的登记 、 标记和存档 ， 便于复核 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ４０４５８ — ２０２１ 附 　 录 　 犃 （ 规范性 ） 植物病原微生物的核酸提取方法 犃 ． １ 　 适用范围 本方法适用于从植物及其产品中提取病原微生物 ＤＮＡ 和 ／ 或 ＲＮＡ ， 适用范围广 ， 可实现植物病原细菌 、 真菌 、 病毒的 ＤＮＡ 和 ＲＮＡ 共提取 。 犃 ． ２ 　 试剂或材料 除非另有规定 ， 仅使用分析纯或生化试剂 。 ＯＭＥＧＡＥ．Ｚ．Ｎ．Ａ． ＴＭ ＰｌａｎｔＤＮＡ ／ ＲＮＡＫｉｔ （ Ｒ６７３３ ） 试剂盒 １ ） （ 包括 ： ＣＰＬ 缓冲液 、 ＤＮＡ 洗涤缓冲液 、 ＰＲ 缓冲液 、 ＲＷＣ 洗涤缓冲液 、 ＲＮＡ 洗涤缓冲液 Ⅱ 、 ＤＮＡ 吸附柱 、 ＲＮＡ 吸附柱 ）、 ２ 巯基乙醇 、 三氯甲烷 、 无水乙醇 。 １ ） 　 ＯＭＥＧＡ 公司生产的 Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ． ＴＭ ＰｌａｎｔＤＮＡ ／ ＲＮＡＫｉｔ （ Ｒ６７３３ ） 试剂盒是适合的市售产品的实例 。 给出这一信 息是为了方便本文件的使用者 ， 并不表示对这一产品的认可 。 如果其他产品具有相同的效果 ， 那么可使用这些 等效产品 。 犃 ． ３ 　 仪器设备 组织细胞破碎仪 、 高速离心机 、 振荡器 、 水浴锅 、 超微量分光光度计 、 电泳系统 、 凝胶成像系统 、 电子分析天平 （ 分度值为 ０．００１ｇ ）、 超净工作台 、 ４℃ 冰箱 、 －８０℃ 超低温冰箱 、 高压灭菌锅 、 制冰机 、 微波炉 。 犃 ． ４ 　 样品 携带病原细菌 、 真菌 、 病毒的植物及其产品 。 犃 ． ５ 　 提取步骤 犃 ． ５ ． １ 　 核酸提取前处理方法 称取 ２００ｍｇ ～ ２ｇ 植物样品或植物种子在液氮中研磨至粉末状 ， 将植物样品粉末或植物种子粉末转入 １．５ｍＬ 离心管中 ， 为保证后续核酸提取质量 ， 每个 １．５ｍＬ 离心管中植物样品粉末 ≤ １００ｍｇ 或植物种子粉末 ≤ ４０ｍｇ 。 随后向每个 １．５ｍＬ 离心管中加入 ５００ μ ＬＣＰＬ 缓冲液 （ 使用前 ， 每 １ｍＬＣＰＬ 缓冲液加入 ２０ μ Ｌ２ 巯基乙醇混合 ， 混合液可在室温条件下保存 １ 个月 ）， ５５℃ 水浴 １０ｍｉｎ 。 加入 ５００ μ Ｌ 三氯甲烷 ， 振荡 ３０ｓ ， １３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ 。 转移 ３５０ μ Ｌ 上清液至新离心管中 ， 并向其中加入 ３５０ μ ＬＰＲ 缓冲液 ， 振荡混匀 ， 将混合液转移至 ＤＮＡ 吸附柱 （ ＤＮＡ 吸附柱放入 ２ｍＬ 收集管中 ）， １００００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １ｍｉｎ ， 将 ＤＮＡ 吸附柱放置室温或 ４℃ 待后续用于 ＤＮＡ 提取 ， 洗脱液用于后续 ＲＮＡ 提取 。 犃 ． ５ ． ２ 　 犇犖犃 提取 将 Ａ．５．１ 所得 ＤＮＡ 吸附柱放入新的 ２ｍＬ 离心管中 ， 向 ＤＮＡ 吸附柱中加入 ５００ μ ＬＤＮＡ 洗涤缓冲液 ， １００００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １ｍｉｎ ， 弃掉滤液 。 向 ＤＮＡ 吸附柱中加入 ５００ μ ＬＤＮＡ 洗涤缓冲液 ， １４０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ２ｍｉｎ ， 弃掉滤液 。 可适当延长离心时间以保证 ＤＮＡ 吸附柱彻底干燥 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ４０４５８ — ２０２１ 将 ＤＮＡ 吸附柱放入新的 １．５ｍＬ 离心管中 ， 向吸附膜中间悬空滴加 ５０ μ Ｌ ～ １００ μ Ｌ 洗脱缓冲液 ， 室温放置 ２ｍｉｎ ， １００００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ２ｍｉｎ ， ＤＮＡ 被