书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ０１ 犆犆犛犅 １６ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ４０６２６ — ２０２１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G24 /G29 /G2A /G2B /G2C /G2D /G2E 犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳 犡犪狀狋犺狅犿狅狀犪狊狆狅狆狌犾犻 （ 犲狓犚犻犱é １９５８ ） 犚犻犱é牔犚犻犱é １９９２ 　 ２０２１  １０  １１ /G2F /G30 ２０２２  ０５  ０１ /G31 /G32 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2F /G30书 书 书前 　　 言 　　 本文件按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２０２０ 《 标准化工作导则 　 第 １ 部分 ： 标准化文件的结构和起草规则 》 的规定起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由全国植物检疫标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２７１ ） 提出并归口 。 本文件起草单位 ： 天津海关动植物与食品检测中心 、 南京农业大学 。 本文件主要起草人 ： 胡佳续 、 姜一 、 刘鹏 、 魏亚东 、 田艳丽 、 胡白石 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ４０６２６ — ２０２１ 杨树细菌性溃疡病菌检疫鉴定方法 １ 　 范围 本文件描述了杨树细菌性溃疡病菌的症状检查 、 分离培养 、 生化特征测定和分子鉴定的方法 。 本文件适用于进出境杨树苗木等植物材料中携带杨树细菌性溃疡病菌的检疫 、 检测和鉴定 ， 以及田间调查和病害监测工作 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。 其中 ， 注日期的引用文件 ， 仅该日期对应的版本适用于本文件 ； 不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＳＮ ／ Ｔ１１９３ 　 基因检验实验室技术要求 ＳＮ ／ Ｔ２６０１ 　 植物病原细菌常规检测规范 ３ 　 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 ４ 　 病菌分类信息 中文名 ： 杨树细菌性溃疡病菌学名 ： 犡犪狀狋犺狅犿狅狀犪狊狆狅狆狌犾犻 （ ｅｘＲｉｄé１９５８ ） Ｒｉｄé＆Ｒｉｄé１９９２ 异名 ： 犃狆犾犪狀狅犫犪犮狋犲狉狆狅狆狌犾犻 Ｒｉｄé１９５８ 犃狆犾犪狀狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狆狅狆狌犾犻 Ｒｉｄé 犡犪狀狋犺狅犿狅狀犪狊狆狅狆狌犾犻 ｓｕｂｓｐ． 狆狅狆狌犾犻 英文名 ： ｂａｃｔｅｒｉａｌｃａｎｋｅｒｏｆｐｏｐｌａｒ 分类地位 ： 变形菌门 （ Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ ）， 变形菌纲 （ Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ ）， 黄单胞菌目 （ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ ）， 黄单胞菌科 （ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ ）， 黄单胞菌属 （ 犡犪狀狋犺狅犿狅狀犪狊 ）。 杨树细菌性溃疡病菌的相关资料参见附录 Ａ 。 ５ 　 方法原理 杨树细菌性溃疡病菌的危害症状 、 菌落形态特征 、 烟草过敏性反应 、 生理生化特性 ， 分子生物学特性以及致病性测试是本文件检疫鉴定方法的原理 。 ６ 　 检测流程 检测流程见图 １ 。 １ 犌犅 ／ 犜 ４０６２６ — ２０２１ 图 １ 　 检测流程 ７ 　 仪器及用具 电子天平 （ 分度值 ： １ ／ １００００ｇ ）、 恒温培养箱 、 高速冷冻离心机 、 掌上离心机 、 纯水仪 、 生物显微镜 、 高压灭菌器 、 聚合酶链反应核酸扩增仪 （ ＰＣＲ 仪 ）、 电泳仪 、 凝胶成像仪 、 超低温冰箱 、 紫外分光光度计 、 加样枪 （ 量程 ： １０ μ Ｌ 、 １００ μ Ｌ 、 １０００ μ Ｌ ）、 培养皿 、 离心管 （ １．５ｍＬ ）、 ＰＣＲ 管 （ ０．２ｍＬ ）、 一次性注射器 （ ２ｍＬ ）、 烧杯 、 三角瓶 、 镊子 、 量筒 、 酒精灯 、 封口膜 、 接种环等 。 ８ 　 主要试剂及培养基 ８ ． １ 　 试剂和材料 除另有规定外 ， 所有试剂均为分析纯 ， 所有试验用水均为灭菌蒸馏水 。 琼脂粉 、 乙二胺四乙酸 （ ＥＤＴＡ ）、 酵母膏 、 蛋白胨 、 牛肉浸膏 、 氯化钠 、 氯化钾 、 葡萄糖 、 蔗糖 、 硫酸镁 （ ＭｇＳＯ ４ · ７Ｈ ２ Ｏ ）、 磷酸氢二钾 （ Ｋ ２ ＨＰＯ ４ ）、 溴酚蓝 （ Ｃ １９ Ｈ １０ Ｂｒ ４ Ｏ ５ Ｓ ）、 七叶灵 （ Ｃ １５ Ｈ １６ Ｏ ９ ）、 柠檬酸铁 ２ 犌犅 ／ 犜 ４０６２６ — ２０２１ （ ＦｅＣ ６ Ｈ ５ Ｏ ７ ）、 三羟甲基氨基甲烷 （ Ｔｒｉｓ ）、 盐酸 、 冰醋酸 （ Ｃ ２ Ｈ ４ Ｏ ２ ）、 氯化镁 （ ＭｇＣｌ ２ ）、 脱氧核糖核苷三磷酸 （ ｄＮＴＰ ）、 ＤＮＡ 聚合酶 （ Ｔａｑ 酶 ）， 氧化酶试纸条 、 细菌微量生化鉴定管 、 溴化乙锭 （ Ｃ ２１ Ｈ ２０ Ｎ ３ Ｂｒ ）、 琼脂糖 、 分子标记 （ ＤＮＡＭａｒｋｅｒ ）、 氢氧化钾 （ ＫＯＨ ） 等 。 ８ ． ２ 　 培养基 蔗糖蛋白胨培养基 、 营养葡萄糖琼脂培养基 （ ＮＤＡ ） 配制按照附录 Ｂ 操作 。 ９ 　 检疫鉴定方法 ９ ． １ 　 症状观察 杨树的病害调查或进出境杨树苗木的现场检疫中 ， 若发现枝条皮层产生裂缝 ， 从裂缝中流出灰褐色细菌菌液 ， 或树干出现肿大的 、 瘤状溃疡斑 （ 见 Ａ．２ 危害情况 ）， 取样带回实验室做进一步分离鉴定 。 ９ ． ２ 　 寄主组织分离培养 按照 ＳＮ ／ Ｔ２６０１ 要求进行操作 。 取疑似溃疡病症状的树段进行病原菌的分离培养 ， 表面用 ７５％ 酒精消毒后 ， 去除树皮 ， 把内部变色木材切成长度和厚度 ３ｍｍ ～ ４ｍｍ 的小块 ， 用无菌水清洗三次 。 在灭菌离心管中加入少量无菌水 ， 将小块病组织放入无菌水中 ， 并用灭菌研磨棒对小块病组织进行碾压研磨 ， １０ｍｉｎ 后用加样枪吸取 ８０ μ Ｌ 病组织浸出液 ， 在蔗糖蛋白胨培养基或 ＮＤＡ 培养基平板上涂布分离 ， 做不少于 ５ 个平板 。 平板置于 ２５℃ 下培养 ４ｄ ～ ５ｄ 后观察 ， 若发现可疑菌落 （ 特征为直径 ３ｍｍ ～ ４ｍｍ ， 圆形 ， 轻微凸起 ， 边缘整齐 ， 黄色奶油状 ）， 则挑取单菌落进行纯化培养 。 若发现染病苗木皮层裂缝流出菌液 ， 可直接用接种环蘸取并在蔗糖蛋白胨培养基或 ＮＤＡ 培养基平板上划线分离 ， 置于 ２５℃ 恒温培养箱中进行培养 ， 每份样品做不少于 ５ 个平板 ， 培养 ４ｄ ～ ５ｄ 后挑取单菌落进行纯化培养 。 ９ ． ３ 　 分离菌的鉴定 ９ ． ３ ． １ 　 革兰氏染色反应 进行革兰氏染色试验 ， 要设置阳性菌的对照 。 若染色结果为革兰氏阴性菌 ， 应进行鞭毛染色试验 。 革兰氏染色应采用 ３％ 氢氧化钾 （ ＫＯＨ ） 溶液进行检测判断 。 用牙签挑取新鲜待测菌落放在载玻片上 ， 与 １ 滴氢氧化钾溶液混匀 ， ３０ｓ 后用牙签慢慢拉出 ， 有拉丝现象的为革兰氏阴性菌 ， 无拉丝现象为革兰氏阳性菌 。 ９ ． ３ ． ２ 　 鞭毛染色反应 若分离菌经生物显微镜观察发现有鞭毛并且鞭毛极生 ， 继续进行生化指标的检测 。 ９ ． ３ ． ３ 　 烟草过敏性反应 取分离的菌株用无菌水配制成约 １０ ８ ＣＦＵ ／ ｍＬ 菌悬液 ， 用灭菌注射器接种烟草叶片背面 ， 置于 ２５℃ 光照培养 ， ２４ｈ ～ ４８ｈ 观察烟草叶片是否出现过敏性坏死反应 。 若叶片出现枯斑情况则为阳性反应 ， 若出现黄斑或不明显变化则为阴性反应 。 同时接种阳性菌株悬液和无菌水分别作为阳性对照和空白对照 。 ９ ． ３ ． ４ 　 生化特征测定 采用微量生化鉴定管对可疑菌株和杨树细菌性溃疡病菌标准菌株进行生化指标检测 ， 该步骤也可 ３ 犌犅 ／ 犜 ４０６２６ — ２０２１ 使用细菌自动鉴定系统等自动化生化指标检测设备 。 杨树细菌性溃疡病菌的生化指标测定结果若为七叶灵水解阴性 ， 明胶液化阴性 ， Ｄ 木糖 、 蜜二糖 、 棉子糖不产酸 ， 能从甘露糖 、 半乳糖和果糖产酸 ， 则继续进行分子方法鉴定步骤 。 生化指标测定方法按照附录 Ｂ 操作 。 ９ ． ３ ． ５ 　 分子特异性检测 ９ ． ３ ． ５ ． １ 　 犇犖犃 模板 采用试剂盒提取细菌 ＤＮＡ 。 按照 ＳＮ ／ Ｔ１１９３ 要求进行分子实验的操作 。 ９ ． ３ ． ５ ． ２ 　 犘犆犚 特异性检测 根据杨树细菌性溃疡病菌 ＲＮＡ 聚合酶 σ ７０ 因子的编码基因 （ 狉狆狅犇 ） 设计特异性引物 ， 扩增片段大小为 １６０ｂｐ ， 检测方法及步骤按照附录 Ｃ 操作 。 ９ ． ３ ． ６ 　 致病性测试 采用杨树感病品种的离体枝条 ， 试验在控温的室内或培养箱中进行 ， 温度控制在 ２０℃ ～ ２５℃ 。 将培养 ４８ｈ 的供试菌株用无菌水配制成约 １０ ８ ＣＦＵ ／ ｍＬ 菌悬液 ， 将枝条截成约 ４０ｃｍ 长的段 ， 在枝条中部切割韧皮部形成伤口 ， 用无菌纱布蘸取菌悬液放置于伤口上 ， 并用保鲜膜包裹 ， 起到保湿的作用 ， 同时接种阳性菌株悬浮液和无菌水分别作为阳