书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ０１ 犆犆犛犅 １６ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ４０６２７ — ２０２１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B /G2C /G2D /G2E 犞犻犪犫犻犾犻狋狔狋犲狊狋狅犳 犔犲狆狋狅狊狆犺犪犲狉犻犪犿犪犮狌犾犪狀狊 （ 犇犲狊犿 ） 犆犲狊 ． 犲狋犇犲犖狅狋 ． 　 ２０２１  １０  １１ /G2F /G30 ２０２２  ０５  ０１ /G31 /G32 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2F /G30书 书 书前 　　 言 　　 本文件按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２０２０ 《 标准化工作导则 　 第 １ 部分 ： 标准化文件的结构和起草规则 》 的规定起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由全国植物检疫标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２７１ ） 提出并归口 。 本文件起草单位 ： 中华人民共和国深圳海关 、 深圳市检验检疫科学研究院 。 本文件主要起草人 ： 高瑞芳 、 章桂明 、 王颖 、 黄河清 、 向才玉 、 李娜 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ４０６２７ — ２０２１ 油菜茎基溃疡病菌活性检测方法 １ 　 范围 本文件描述了应用普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜对油菜茎基溃疡病菌 ［ 犔犲狆狋狅狊狆犺犪犲狉犻犪犿犪犮狌犾犪狀狊 （ Ｄｅｓｍ． ） Ｃｅｓ．ｅｔＤｅＮｏｔ． ］ 分生孢子进行活性检测的方法 。 本文件适用于油菜茎基溃疡病菌相关寄主中携带的油菜茎基溃疡病菌分生孢子的活性检测鉴定 。 ２ 　 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件 。 ３ 　 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 ４ 　 原理 应用荧光染料对油菜茎基溃疡病菌分生孢子进行染色处理 ， 根据碘化丙啶 （ ＰｒｏｐｉｄｉｕｍＩｏｄｉｄｅ ， ＰＩ ） 能够穿透正在死亡或者已经死亡的细胞膜 ， 不能透过具有活力的细胞膜 ， 使不具活性的孢子发出红色荧光 、 具有活性的孢子不发出荧光的特点 ， 运用普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜对荧光染料处理的分生孢子进行检测 ， 分析其活性情况 。 油菜茎基溃疡病菌基本信息见附录 Ａ 。 ５ 　 仪器和试剂 ５ ． １ 　 试剂 碘化丙啶 （ ＰＩ ） 溶液配置方法 ： 称取 ０．０１ｇＰＩ 粉末 ， 加入 １０ｍＬ 无菌水 ， 配制成浓度为 １ｍｇ ／ ｍＬ 的 母液 ， 置于棕色瓶 ４℃ 避光保存 ， 使用前配制所需浓度 。 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 （ ＰＤＡ ）： ２００ｇ 去皮土豆切成小方块 ， 加入 １０００ｍＬ 自来水 ， 煮沸 １５ｍｉｎ ， 四层纱布过滤得到滤液 ， 滤液中加入 １８ｇ 葡萄糖 、 １８ｇ 琼脂粉 ， 加热溶解后将溶液定容至 １０００ｍＬ ， 分装到三角瓶中 ， １２１℃ 高压蒸汽灭菌 ２０ｍｉｎ 。 ５ ． ２ 　 设备 激光扫描共聚焦显微镜或普通荧光显微镜 、 高压灭菌锅 、 生物安全柜 、 生化培养箱 、 冰箱 、 离心机 。 ６ 　 活性检测方法 ６ ． １ 　 检测样品制备 在超净工作台中 ， 用解剖针将油菜茎基溃疡病菌分生孢子挑到灭菌水中 ， 充分振荡 ３ｍｉｎ ， 在显微 １ 犌犅 ／ 犜 ４０６２７ — ２０２１ 镜下检测样品浓度 ， 确定稀释比例 ， 配制成终浓度为 １０ 个孢子 ／ μ Ｌ ～ １００ 个孢子 ／ μ Ｌ 的孢子悬浮液 ， 镜检 ， 备用 。 ６ ． ２ 　 孢子染色 取 １９９ μ Ｌ 孢子悬浮液 ， 加入 １ μ Ｌ 质量浓度为 ０．１ｍｇ ／ ｍＬ 的 ＰＩ 染料 ， 混匀 ， 室温下避光染色 ４ｍｉｎ ， 染色完成后 ， １６０００ 犵 离心 １ｍｉｎ 去上清液终止染色 ， 加入灭菌去离子水洗涤一次 ， 重新悬浮 。 避光放置备用 。 ６ ． ３ 　 普通荧光显微镜检测 ６ ． ３ ． １ 　 制片 吸取 ５ μ Ｌ 活性染料处理之后的样品制备玻片 ， 封片 ， 放置于普通荧光显微镜载物台上 ， 低倍镜下找到孢子 ， 转到 １００ 倍油镜下观察 ， 微调至视野内图像清晰 。 ６ ． ３ ． ２ 　 检测 至少检测 ３０ 个孢子 ， 观察染色情况 。 ＰＩ 染色检测 ： 将荧光光路打开 ， 设置荧光通道的激发波长 ５３４ｎｍ ， 收集荧光信号的发射波长 ６１７ｎｍ ， 收集荧光信号 。 微调至视野内图像清晰 。 染色结果参见附录 Ｂ 。 为了保证图像能够反映出孢子最真实的荧光染色情况 ， 首先需要确认明场通道下所得到孢子符合油菜茎基溃疡病菌分生孢子形态特征 ， 且图像清晰 。 ６ ． ４ 　 激光扫描共聚焦显微镜检测 ６ ． ４ ． １ 　 制片 吸取 ５ μ Ｌ 活性染料处理之后的样品制备玻片 ， 封片 ， 置于激光扫描共聚焦显微镜载物台上 ， 低倍镜下找到孢子 ， 转到 １００ 倍油镜下观察 ， 微调至视野内图像清晰 。 ６ ． ４ ． ２ 　 激光设置 选择相应的激光管 （ 氩离子激光器 ） 激发荧光信号 ， ＰＩ 检测设置荧光通道的激发波长 （ ５３４ｎｍ ）， 收集荧光信号的发射波长 （ ６１７ｎｍ ）， 并设置一个明场通道作为对照 。 ６ ． ４ ． ３ 　 扫描设置 选择低像素扫描模式扫描 （ ｘｙ ： ５１２×５１２ ）， 重复扫描次数 Ａｖｅｒａｇｅ 为 １ 次 ， 扫描速度 Ｓｐｅｅｄ 为 ９ ， 根据成像效果调整探测针孔 Ｐｉｎｈｏｌｅ 、 光电倍增管增益 Ｇａｉｎ 和激光扫描强度 ＳｃａｎＳｔｒ 等参数 ， 将图像调整至质量较好的效果 。 再用精确扫描方式 （ ｘｙ ： ２０４８×２０４８ ） 根据信噪比调整扫描模式 ， 选择精确像素的平面扫描方式进行粗略扫描 （ ｘｙ ： ２０４８×２０４８ ）， 重复扫描次数 Ａｖｅｒａｇｅ 为 ２ 次 ， 扫描速度 Ｓｐｅｅｄ 为 ６ ， 获取最终图像 。 ６ ． ４ ． ４ 　 检测 扫描至少 ３０ 个孢子 ， 观察染色结果 。 为了保证图像能够反映出孢子最真实的荧光染色情况 ， 首先需要确认明场通道下所得到孢子符合油菜茎基溃疡病菌分生孢子形态特征 ， 且图像清晰 。 ６ ． ５ 　 萌发试验 取孢子悬浮液 １００ μ Ｌ ， 均匀涂布于 ＰＤＡ 培养基上 ， 用封口膜封口 ， 置于 ２５℃ 培养 ９ｈ 以上 ， 观察孢 ２ 犌犅 ／ 犜 ４０６２７ — ２０２１ 子萌发情况 ， 以芽管长度大于孢子本身长度视为萌发 。 ７ 　 结果判断与表述 结果判断与表述如下 ： ——— 孢子染色后通过普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜随机扫描至少 ３０ 个孢子 ， 所扫描的孢子中 ， 所有孢子均无红色荧光 ， 判定油菜茎基溃疡病菌孢子具有活性 ， 参见附录 Ｂ ； ——— 孢子染色后通过普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜随机扫描至少 ３０ 个孢子 ， 所扫描的孢子中 ， 所有孢子均呈红色荧光 ， 判定油菜茎基溃疡病菌孢子不具活性 ， 参见附录 Ｂ ； ——— 激光扫描共聚焦显微镜或普通荧光显微镜扫描结果 ， 存在少数分生孢子或个别分生孢子具有很弱的荧光 ， 而无法判断孢子活性的 ， 则对未染色的孢子进行萌发实验 ， 根据萌发情况判定 ， 如萌发则判定具有活性 ， 如不萌发则判定不具有活性 。 ８ 　 样品与原始数据保存 ８ ． １ 　 样品保存 存查样品应在 ４℃ 条件下妥善保存 ６ 个月 。 如发现具有活性的油菜茎基溃疡病菌孢子的 ， 该样品应保存 １ 年 ， 以备复验 ， 如涉及贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕 。 保存期满后 ， 需经灭菌处理 。 ８ ． ２ 　 原始数据保存 样品检测结束后 ， 其原始记录单和检验结果或证书应归档 ， 妥善保管 ， 以备复验 、 谈判和仲裁 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ４０６２７ — ２０２１ 附 　 录 　 犃 （ 资料性 ） 油菜茎基溃疡病菌相关信息 犃 ． １ 　 基本信息 英文名 ： Ｃｒｕｃｉｆｅｒｓｓｔｅｍｃａｎｋｅｒ ， Ｃｒｕｃｉｆｅｒｓｂｌａｃｋｌｅｇ ， Ｐｈｏｍａｌｅａｆｓｐｏｔ ， Ｃｒｕｃｉｆｅｒｓｃａｎｋｅｒ ， Ｃｒｕｃｉｆｅｒｓｄｒｙｒｏｔ ， Ｂｌａｃｋｌｅｇｏｆｃａｂｂａｇｅ 学名 ： 犔犲狆狋狅狊狆犺犪犲狉犻犪犿犪犮狌犾犪狀狊 （ Ｄｅｓｍ ） Ｃｅｓ．ｅｔＤｅＮｏｔ． 无性态 ： 犘犺狅犿犪犾犻狀犵犪犿 （ Ｔｏｄｅ ） Ｄｅｓｍ． 分类地位 ： 真菌界 （ Ｆｕｎｇｉ ）， 子囊菌门 （ Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ ）， 座囊菌纲 （ Ｄｏｔｈｉｄｅｏｍｙｃｅｔｅｓ ）， 格孢腔菌目 （ Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｌｅｓ ）， 小球腔菌科 （ Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ ）， 小球腔菌属 （ 犔犲狆狋狅狊狆犺犪犲狉犻犪 ） 传播途径 ： 病菌以子囊壳和菌丝体在病残体中越夏和越冬 。 菌丝体在土中可存活 ２ 年 ～ ３ 年 ， 在种子内可存活 ３ 年 ， 子囊壳在残株中可存活 ５ 年以上 。 病菌分生孢子可借风雨做短距离传播 ， 病残体和带菌种子是远距离传播的主要方式 。 犃 ． ２ 　 寄主范围 主要寄主是油菜以及其他十字花科蔬菜 ， 包括芸薹属 （ 犅狉犪狊狊犻犮犪 ） 的