ICS 65.020.30 CCS B 44 22 吉林省 地方标准 DB22/T 3678—2024 普通级实验用猫 金黄色葡萄球菌检测 PCR 法 Detection of conventional experimental cat Staphylococcus aureus PCR method 2024-12-31发布 2025-02-10实施 吉林省市场监 督管理厅 发布 DB22/T 3678 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件中的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由吉林省科学技术厅提出并归口。 本文件由吉林省科学技术厅组织实施。 本文件标准起草单位：吉林大学。 本文件标准主要起草人：高飞、袁宝、任文陟、刘殿峰、张嘉保、 高巍、陈健、胡进平、权福实。 DB22/T 3678 —2024 1 普通级实验用猫 金黄色葡萄球菌检测 PCR法 1 范围 本文件描述了普通级实验用猫金黄色葡萄球菌的 PCR检测方法，给出了试验原理、材料、样品、试 验步骤和结果判定。 本文件适用于普通级实验用猫金黄色葡萄球菌检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 根据金黄色葡萄球菌 nuc 基因设计特异性引物进行 PCR扩增反应，通过凝胶电泳检测，判定检测结 果。 5 仪器设备 仪器设备包括但不限于： a) 高速离心机，离心速度： 1000 r/min ～20000 r/min ； a) PCR扩增仪； b) 电泳仪； c) 凝胶成像系统； d) 恒温培养箱，温度： 36 ℃±1 ℃； e) 微量移液器（量程： 5 µL～50 µL，50 µL～200 µL，100 µL～1000 µL）； f) 均质器。 6 材料 材料包括但不限于： a) 阳性对照品： 金黄色葡萄球菌标准菌株（ ATCC25923 ）； DB22/T 3678 —2024 2 b) 阴性对照品：无菌水； c) 7.5% 氯化钠营养肉汤，配制方法 按 A.1 配制； d) 1.5% 琼脂糖凝胶，配制方法 按 A.2配制； e) DNA 染料； f) 1% 溴酚蓝，配制方法 按 A.3 配制； g) 50×TAE 电泳缓冲液，配制方法 按 A.4 配制； h) 无 RNase 去离子水，配制方法 按 A.5 配制； i) DNA 标准标志物： 100 bp～2000 bp； j) 70% 乙醇溶液（用无 RNase去离子水配制） ； k) 核苷酸混合物（ dNTPs）。 7 样品 采集 7.1.1 死亡猫 7.1.1.1 无菌采集胃 、肠道等典型病灶组织或内容物。 7.1.1.2 用灭菌接种环挑取适量 7.1.1.1 样品，加入 4 mL 7.5% 氯化钠营养肉汤， 均质后置于 （36 ℃±1 ℃）培养箱中培养 18 h～24 h，取上清液 ，注明编号后备用。 7.1.2 活体猫 7.1.2.1 采集中段粪便，干粪便加入 7.5%氯化钠营养肉汤 均质后进行接种，稀便直接接种培养 。置于 培养箱中 36 ℃ 培养 18 h～24 h，取上清液 ，注明编号后备用。 7.1.2.2 无菌采集分泌物或浓汁接种在 7.5% 氯化钠营养肉汤 中，置于培养箱中 36 ℃ 培养 18 h～ 24 h，取上清液 ，注明编号后备用。 存放 采集或处理的样品在 2 ℃～8 ℃ 条件下保存应不超过 24 h；如需长期保存，应放置在 -80 ℃ 冰箱中。 运输 按照 NY/T 541 的规定操作 。 8 试验步骤 DNA的提取 采用商品化 DNA 提取试剂盒，按说明书方法进行操作；或采用等效方法提取。 PCR扩增目的片段 8.2.1 反应体系 PCR反应体系见表 1。上游引物为 5’-GCTTGCTATGATTGTGGTAGCC -3’，下游引物为 5’- CTCTAGCAAGTCCCTTTTCCAC -3’，产物DNA片段长度为 423 bp，产物基因序列应符合 B.1。 DB22/T 3678 —2024 3 表1 PCR 反应体系 试剂 用量/µL 10×Buffer 2.5 dNTP（2.5 µmol/L） 0.7 上游引物（ 20 µmol/L） 0.25 下游引物（ 20 µmol/L） 0.25 DNA 模板（20 ng/µL～50 ng/ µl） 2.0 TaqE（5 U/µL） 0.7 ddH2O（去离子水） 18.6 总体积 25 8.2.2 PCR反应参数 PCR 反应参数 见表 2。 表2 PCR 反应参数 序号 步骤 温度/℃ 时间 循环数 1 预变性 95 5 min 1 2 变性 95 40 s 35 3 退火 60 30 s 4 延伸 72 60 s 5 再延伸 72 8 min 1 注： 可使用其他等效 PCR 检测试剂盒进行，反应体系和反应参数可做相应调整。 8.2.3 质量控制 金黄色葡萄球菌标准菌株 DNA 作为阳性对照；用不含有金黄色葡萄球菌的其他细菌 DNA 作为阴 性对照；用无菌水代替 DNA 模板作为空白对照。 8.2.4 电泳检测 配制含DNA染料的 1.5% 琼脂糖凝胶，取 7 µL～15 µL 混有溴酚蓝的 PCR 产物加入到凝胶孔中， 与适合的 DNA 标准标志物做对比；电压 60 V～100 V 进行电泳，当溴酚蓝移动到距离胶板下缘 1 cm 处时，停止电泳。将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统中，观察 PCR 反应结果 。 结果判定 8.3.1 阴性对照和空白对照未出现目的条带，阳性对照出现 423 bp 特异性目的条带，试验成立；否 则重新检验。 8.3.2 检测样品未观察到 423 bp 处有扩增条带，样品检测结果为阴性；检测样品观察到 423 bp 处 有扩增条带，样品检测结果为阳性，应符合图 B.2。 DB22/T 3678 —2024 4 A A 附录 A （规范性） 溶液的配制 A.1 7.5%氯化钠营养肉汤 称取蛋白胨 10 g，牛肉浸粉 3 g，氯化钠 75 g，放入烧杯中，用 1 L 双蒸水加热搅拌充分溶解， 调整 pH 7.4±0.2 ；121 ℃ 高压灭菌 15 min，密封冷却备用。 A.2 含 DNA 染料的 1.5% 琼脂糖凝胶 称取 1.5 g 琼脂糖放入烧杯中，加入 100 mL 1×TAE 电泳缓冲液，混合后加热至完全融化，放在 室温冷却至 50℃～55℃ 时，向其中加入 DNA 染料，轻轻晃动混匀，避免产生气泡，将电泳梳子置入 制胶板中，然后将琼脂糖溶液倒入制胶板，凝胶适宜厚度为 3 mm～5 mm，需确认在梳齿下或梳齿间没 有气泡，待凝固后取下梳子备用。 A.3 1% 溴酚蓝 称取 1 g 水溶性钠型溴酚蓝放入烧杯中，再向烧杯中加入 100 mL 双蒸水，搅拌或涡旋混合直到 完全溶解。 A.4 50× TAE 电泳缓冲液 称取 242 g 羟基甲基氨基甲烷（ Tris）和 37.2 g EDTANa 2·2H 2O 放入1 L 烧杯中，再向烧杯中 加入 800 mL 双蒸水，充分搅拌均匀；加入 57.1 mL 冰醋酸；用 NaOH 调至 pH 8.3，加双蒸水定容 至 1 L，室温保存备用。用时用双蒸水稀释至 1× 使用。 A.5 无 RNase 去离子水 去离子水按体积比 0.1% 加入 DEPC 摇匀，室温静置过夜， 121 ℃ 高压灭菌 15 min，冷却备用。