ICS 65.020.30 CCS B 44 22 吉林省 地方标准 DB22/T 3680—2024 实验用水貂 胚胎采集及移植技术规程 Technical code of experimental mink embryo collection and transfer 2024-12-31发布 2025-02-10实施 吉林省市场监督管理厅 发布 DB22/T 3680 —2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件中的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由吉林省科学技术厅提出并归口。 本文件由吉林省科学技术厅组织实施。 本文件起草单位：中国农业科学院特产研究所 。 本文件主要起草人：刁云飞、李晓霞、许保增、赵伟刚、徐超、魏海军、杨镒峰、张颖、唐毓。 DB22/T 3680 —2024 1 实验用水貂 胚胎采集及移植技术规程 1 范围 本文件确立了实验用水貂胚胎采集及移植的技术程序， 规定了水貂选择、公貂结扎、输卵管采集、 冲胚、胚胎移植、胚胎质量鉴定的操作指示，描述了档案记录的追溯方法。 本文件适用于水貂胚胎的采集及移植。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新 版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 35823 实验动物 动物实验通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 冲胚液 embryo flushing medium 用于采集胚胎时，将胚胎从输卵管或子宫角中冲洗出体外并提供保护的化学试剂 。 胚胎保存液 embryo preservation medium 用于暂时保存采集到的胚胎，提供营养、保护的化学试剂 。 4 技术流程 实验用水貂胚胎采集及移植技术包括水貂的选择、 公貂结扎、 供体与受体水貂的配种、 输卵管采集、 冲胚、胚胎收集、胚胎质量鉴定、胚胎移植。实验用水貂胚胎采集及移植技术流程见图 1。 DB22/T 3680 —2024 2 图1 技术流程图 5 水貂的选择 体况健康良好，生殖机能正常，且处于发情期 。 6 公貂结扎 术前准备 6.1.1 药品包括麻醉药、苏醒药，器材选择参见表 A.1。 6.1.2 水貂手术前应禁食 6 h～12 h。 6.1.3 将水貂进行全身麻醉。麻醉后，应将水貂腹部朝上，平放于手术台。 6.1.4 对麻醉后的水貂睾丸下部阴囊缝际处进行备皮，先用 5% 碘酊进行消毒，再用 75% 酒精脱碘。 手术 6.2.1 在睾丸下部阴囊缝际一侧，平行于缝际，切开皮肤、肉膜、总鞘膜，做一个 2 cm 切口，将睾 丸及输精管暴露。 6.2.2 用尖头镊子，将与附睾距离 2 cm 处的输精管与系膜小心分离，将剪刀尖部在酒精灯烧热后， 将两侧输精管中间段各剪掉 0.5 cm。 记录与档案 （见第11章） 供体水貂配种 （见第7章） 水貂的选择 （见第5章） 输卵管采集 （见第8章） 冲胚、胚胎收集与质量鉴定 （见第9章） 胚胎质量鉴定 （见9.3） 待移植 胚胎收集 （见9.2） 冲胚 （见9.1） 公貂结扎 （见第6章） 受体同期交配 排卵刺激 （见10.1.2） 待移植 胚胎移植 （见第10章） DB22/T 3680 —2024 3 6.2.3 将睾丸放回阴囊内，使用可吸收外科缝合线将切口进行缝合，用 5% 碘酊消毒。 术后 完全康复后可用于交配。 7 供体水貂配种 将供体水貂与种公貂同笼配种， 交配完成后及时将供体水貂放回原笼内。 每天 1 次， 连续交配 2 d。 8 输卵管采集 采集前准备 8.1.1 药品及试剂包括麻醉药、苏醒药，器材的选择参见表 A.1。 8.1.2 供体水貂第二次交配后第 2 d 进行输卵管采集。 8.1.3 术前禁食 6 h～12 h。 8.1.4 供体水貂麻醉按 6.1.3 执行。 8.1.5 对麻醉后的水貂腹中线倒数第二乳头处进行备皮， 先用 5% 碘酊进行消毒， 再用 75% 酒精脱碘。 手术采集 8.2.1 在腹中线倒数第二乳头处做一个 2 cm 左右切口，将两侧子宫角、输卵管、卵巢暴露，观察左 右卵巢黄体发育情况并记录，记录表见 C.1。在子宫角和输卵管结合部的子宫角端用可吸收缝合线进行 结扎，将卵巢与输卵管用眼科剪进行剥离采集，将取下的输卵管放置在冲胚液中保存。 8.2.2 将结扎好的子宫复位回腹腔内， 用可吸收外科缝合线将腹膜与肌肉层连续缝合， 皮肤结节缝合， 用 5% 碘酊消毒。 9 冲胚、胚胎收集与质量鉴定 冲胚 将 8.2.1 采集到的输卵管放在平皿里进行冲胚。使用无针头注射器吸入 5 mL 冲胚液（冲胚液配 制方法参见表 B.1），安装冲胚针从输卵管伞口处插入，用镊子将包裹冲胚针处的输卵管夹紧，将 5 mL 冲胚液缓慢的注入到输卵管中，使胚胎随着冲胚液从输卵管另一端流出至平皿中。 胚胎收集 在体式显微镜下收集冲胚液中的胚胎。将收集到的胚胎放入胚胎保存液中（胚胎保存液配制方法参 见表 B.2）。 胚胎质量鉴定 9.3.1 胚胎检查 在无菌操作室内，将存放胚胎的平皿放在 37 ℃ 恒温板上，体视显微镜下检查、对胚胎质量进行 分级、鉴定胚胎发育阶段并记录，记录表见 C.1。放入 38.5 ℃、5% CO 2 浓度的饱和湿度培养箱中保存 直至后续实验或胚胎移植。 DB22/T 3680 —2024 4 9.3.2 胚胎质量分级 9.3.2.1 第二次配种后第 2 d，胚胎应为 1 细胞期或 2 细胞期。 9.3.2.2 胚胎可分为 A、B、C、D四个等级， A 级、B 级为可用胚胎， C 级、D 级为不可用胚胎。 a) A 级：胚胎发育阶段与胚龄一致，轮廓清晰，卵周隙适中，若 2 细胞期则分裂球大小均匀、 结构紧凑。 b) B 级：胚胎发育阶段与胚龄基本一致，轮廓清晰，细胞球略收缩或膨胀，卵周 隙略大或略小， 若 2 细胞期分裂球大小基本一致。 c) C 级：胚胎发育阶段与胚龄不太一致，轮廓尚清晰，细胞球收缩较大或膨胀过大，卵周隙大 或无卵周隙。 d) D 级：胚胎发育阶段与胚龄不一致，轮廓不清晰，细胞膜破裂，细胞质松散、游离。 10 胚胎移植 移植前准备 10.1.1 药品包括麻醉药、苏醒药，器材选择参见附录表 A.1。 10.1.2 将与供体水貂同期发情的受体水貂与结扎公貂同笼交配刺激排卵，每天 1 次，连续 2 d。受 体配种信息进行记录，记录表见 C.2。 10.1.3 受体水貂麻醉操作方法按 6.1.3 执行，备皮、消毒操作方法按 8.1.5 执行。 胚胎移植 10.2.1 在腹中线倒数第二乳头处做一个 2 cm 左右切口，将子宫角、输卵管、卵巢暴露。 10.2.2 在输卵管的膨大部，用 1 mL 注射器针头穿一个小孔，用口吸管连接胚胎移植针吸取 5 枚胚 胎，将胚胎移植针小心插入输卵管小孔中，缓慢的将全部胚胎注入输卵管中，避免注入大量气体，完成 后将胚胎移植针缓慢拔出。按照同样方法将 5 枚胚胎移植入另一侧输卵管中。 10.2.3 移植完成后，将卵巢、输卵管与子宫复位回腹腔。用可吸收外科缝合线将腹膜与肌肉层连续缝 合，皮肤结节缝合，用 5% 碘酊消毒。 10.2.4 胚胎移植信息进行记录，记录表见 C.2。 11 记录与档案 记录档案应完整，并保存 1 年以上。