ICS 65.020.01 CCS B 60 DB23 黑龙江省地方标准 DB23/T 3733—2024 红松无性系 SSR鉴别技术规程 2024-8-30发布 2024-9-29实施 黑龙江省市场监督管理局 发布 DB23/T 3733—2024 前 言 本文件依据GB/T 1.1 -2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由黑龙江省林业和草原局提出。 本文件由黑龙江省林业和草原局标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：东北林业大学、佳木斯市孟家岗林场、苇河林业局青山林木种子园、宁安市渤海林 木种子园、 五常市宝龙店种子林场、鹤岗市林木良种繁育中心。 本文件主要起草人：张含国、闫平玉、张 磊、孙国飞、潘凤刚、李金泉、石宝英、胡振宇、曹振宇、 李志新。 DB23/T 3733—2024 1 红松无性系 SSR鉴别技术规程 1 范围 本文件规定了红松（ Pinus koraiensis Siebold & Zucc. ）无性系 SSR鉴别技术 中技术原理、 仪器设备及 试剂、溶液配制、操作程序、数据记录与统计、判定规则及档案管理等要求。 本文件适用于红松无性系的 SSR指纹数据采集及品种鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件仅 该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 核心引物 快速、准确、稳定鉴定无性系的 SSR 引物。 3.2 补充引物 核心引物检测出不同无性系差异位点数小于 2 时可选择的引物。 4 缩略语 DNA： DeoxyriboNucleic Acid 脱氧核糖核酸。 PCR：Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应 。 SSR：Simple Sequence Repeats 简单重复序列。 EDTA：Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸 。 TEMED：N,N,N',N' -Tetramethylethylenediamine 四甲基乙二胺 。 dNTP：deoxy-ribonucleoside triphosphate 脱氧核糖核苷三磷酸 。 PAGE：Polyacrylamide Gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶 电泳。 CTAB：Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide 十六烷基三甲基溴化铵 。 TBE：Tris-Borate -EDTA buffer -硼酸-乙二胺四乙酸二钠缓冲液 。 5 技术原理 5.1 遗传差异 由于不同红松无性系遗传组成不同，基因组 DNA中SSR的重复次数存在广泛差异。 DB23/T 3733—2024 2 5.2 检测技术 简单重复序列差异可以通过 PCR扩增及电泳方法进行检测，从而区分不同红松无性系。 6 仪器设备及 试剂 6.1 主要仪器设备 PCR扩增仪； 电泳仪（ 具有恒电压、恒电流功能）； 垂直电泳槽及配套的制胶附件；水平电泳槽及配 套的制胶附件； 高速离心机 （最大离心力大于 15 000 g）； 水平摇床 ；电子天平 （精度为 0.1 mg）；微量移 液器（规格分别为 2.5 μL、20 μL、200 μL 、1 000 μL ，连续可调 ）；磁力搅拌器 ；超微量分光光度计 ；微波 炉；高压灭菌锅；水浴锅；超低温冰箱 （最低温度- 80 ℃）；制冰机；凝胶成像系统 。 6.2 主要试剂 十六烷基三乙基溴化铵 ；三氯甲烷 ；异丙醇；异戊醇 ；乙二胺四乙酸二钠 二水合物； 三羟甲基氨基甲 烷；氢氧化钠 ；浓盐酸；10×缓冲液 （含 Mg2+ 25 mmol/L ）；dNTP；DNA聚合酶；琼脂糖；DNA分子量 标准；核酸染色剂 ；去离子甲酰胺 ；溴酚蓝 ；二苯甲青；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺 ；硼酸； 无水乙醇 ； 过硫酸铵； 硝酸银；甲醛。 7 溶液配制 7.1 DNA提取溶液 0.5mol/L HCI 溶液：25 mL浓盐酸（36%~38% ），加水定容至 500 mL。 TE：1 mol/L Tris -HCl溶液 5 mL，0.5 mol/L EDTA 溶液 1 mL，加0.5mol/L HCI 溶液调pH至8.0，定容 至500 mL。 0.5 mol/L EDTA 溶液：186.1 g 乙二胺四乙酸二钠 二水合物 溶于 800 mL水中，氢氧化钠 调pH至8.0， 定容至 1 L，高压灭菌。 1mol/L Tris -HCI 溶液：60.55 g 三羟甲基氨基甲烷 溶于适量水中 ，加0.5mol/L HCI 溶液调pH至8.0定 容至 500 mL，高压灭菌。 CTAB提取液：81.7 g氯化钠和 20 g CTAB 溶于适量水中 ，加1 mol/L Tris -HCl溶液 100 mL，0.5 mol/L EDTA 40 mL ，定容至 1 L，4℃贮存。 7.2 PCR扩增溶液 SSR引物：用超纯水分别配制前引物和后引物终浓度均 10 μmol/L 的工作液。 加样缓冲液 （6×）：去离子甲酰胺 49 mL，0.5 mol/L 的EDTA溶液 1 mL，溴酚蓝 0.125 g， 二甲苯青 0.125 g。 7.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液 30% PAGE胶：丙烯酰胺 290 g，甲叉双丙烯酰胺 10 g，定容至 1 L。 7% PAGE胶： 10× TBE 50 mL，30% PAGE 胶233.3 mL ，定容至 1 L。 25%过硫酸铵溶液 ：0.25 g过硫酸铵溶于 1 mL超纯水中。 TBE（10×）：三羟甲基氨基甲烷 108 g，硼酸 55 g，0.5 mol/L EDTA 溶液 37 mL，定容至 1 L。 TBE（0.5×）：10×TBE 50 mL，加水定容至 1 L。 7.4 银染溶液 DB23/T 3733—2024 3 染色液： 1 g硝酸银，定容至 1 L。 显影液： 1 L蒸馏水，加入 15 g氢氧化钠和 5 mL甲醛，混匀（甲醛现用现加） 。 银染溶液的配制使用符合 GB/T 6682 中4.3规定的三级水 ，试验过程使用符合分析纯的试剂和 GB/T 6682中4.3规定的一级水。 8 操作程序 8.1 样品 要求 送检样品宜 为一年生针叶， -80 ℃超低温冷冻保存。同一红松无性系 样品数量应大于 5个。 8.2 DNA提取 使用CTAB 提取法， 或适合 SSR指纹技术的商业试剂盒进行DNA 提取。琼脂糖凝胶（ 1%）电泳检测 DNA质量并进行 浓度测定，稀释至 20 ng/μL充分溶解后备用。 8.3 PCR扩增 8.3.1 引物选择 引物信息包括核心引物信息和补充引物信息。 选择使用核心引物进行检测， 核心引物信息见附录 A.1。当检测出不同无性系差异位点数小于 2 时， 选择使用 补充引物进行检测 ，补充引物信息见附录 A.2。 8.3.2 反应体系 PCR反应采用 20μL体系。 8.3.3 反应程序 94 ℃预变性 3 min，1个循环； 94 ℃变性 30 s，51 ℃ ~60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 15 s，共 35个循环； 72 ℃延伸 7 min，4 ℃保存。 8.4 PCR产物检测 8.4.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳 8.4.1.1 清洗玻璃板 将玻璃板擦洗干净，双蒸水擦洗 2遍， 95%乙醇擦洗 2遍，干燥。 8.4.1.2 组装制胶板 待玻璃板彻底干燥后组装电泳板 ，调平。 8.4.1.3 灌胶 在40 mL 7% PAGE 胶中加入 TEMED和25%过硫酸铵各 60 μL，迅速混匀后匀速灌胶，以防出现气泡， 在上部插入梳子，使其聚合 1 h，凝胶规格为 186 mm ×95 mm ×1 mm。 8.4.1.4 电泳 拔去梳子后 ，使用移液器吹吸点样孔，清除气泡和杂质，每一个加样孔点入 1 μL混合有加样缓冲液 （终浓度为 1×）的样品，180 V 恒电压电泳 1 h。电泳结束后分开两块玻璃板，取下凝胶。 DB23/T 3733—2024 4 扩增片段大小在 150 bp以下时应缩短电泳时间，扩增产物片段在 300 bp以上时应延长电泳时间，以保 证片段分离效果。 8.4.1.5 银染 染色：凝胶置于染色液中水平摇动染色 8 min； 漂洗：双蒸水快速漂洗 15 s; 显影：凝胶置于染色液中水平摇动至带纹出现； 漂洗：双蒸水漂洗 1 min。 9 数据记录与统计 9.1 数据记录 将每个扩增位点的等位变异片段大小进行比较，确定样品在该位点的等位变异；纯合位点的基因型数 据记录为 X/X，杂合位点的基因型数据