ICS65.020.30 CCS B4423 黑 龙 江 省 地 方 标 准 DB 23/T 3 767—2024 奶牛趾间皮肤外植体构建技术规程 TechnicalRegulationforconstructioninintertoeskinexplantofdairy cows 2024-0 8- 30发布 2024- 0 9-29实施 黑龙江省市场监督管理局  发布DB 23/T 3 767—2024 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由黑龙江省农业农村厅提出。 本文件起草单位：黑龙江八一农垦大学、东北农业大学、黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院。 本文件主要起草人：郑家三、刘云、邵广、张鹤飞、周志新、葛延松、徐恩爽、韩欢胜、王峥、孙 悦、杨春雪、田雪。DB 23/T 3 767—2024 II引言 近年来，在市场和政策的推动下，以及地处北纬43～53°世界公认的黄金“奶牛带”这一得天独厚 的资源优势，黑龙江省奶牛规模养殖发展速度迅速，随之而来的是一些奶牛群发生产疾病特别是奶牛肢 蹄病的发病率呈上升趋势，对我省奶牛养殖行业的健康发展造成了巨大的威胁。在奶牛肢蹄病中蹄病发 病率约占90%以上，根据表现形式可分为感染性和非感染性两类，常见的感染性蹄病主要包括腐蹄病、 蹄趾皮炎和趾间皮炎等，奶牛蹄病一直是困扰奶牛健康养殖的难题，深入阐明奶牛蹄病的病原易感性及 其炎症发生机制是十分必要的。以往对奶牛蹄部感染性疾病的研究往往采用活体实验，不仅给实验带来 诸多不便，而且实验成本高昂，更重要的是违背动物福利原则，因此寻找一种可替代的离体实验模型具 有重要的现实意义，基于以上目的，本文件提出构建奶牛趾间皮肤外植体。DB 23/T 306 7—2024 3奶牛趾间皮肤外植体构建技术规程 1范围 本文件规定了奶牛趾间皮肤外植体的来源、采样、构件材料、活性检测方法、构建成功评定方法的 要求。 本文件适用奶牛趾间皮肤外植体的构建。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB16568-2006奶牛场卫生规范 DB2306/T096-2019《奶牛蹄部疾病诊断技术规程》 DB23/T1618-2015奶牛蹄保健技术规范 DB61/T367.16-2022荷斯坦牛生产技术规范第16部分：肢蹄病防治 GB/T27830-2011化学品体外皮肤腐蚀人体皮肤模型试验方法 SN/T4577-2016化妆品皮肤刺激性检测重建人体表皮模型体外测试方法 JY0315-1991皮肤结构模型技术条件 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 皮肤外植体 从活体动物切取下来进行培养的皮肤组织。 4要求 4.1外植体皮肤来源要求 4.1.1以新屠宰的奶牛后蹄趾间皮肤为外植体皮肤来源。 4.1.2外植体所用的皮肤需从无蹄部疾病且蹄型结构良好的奶牛后蹄蹄叉处采集。 4.2人员要求 4.2.1具有扎实的兽医外科专业知识，且熟练掌握兽医外科手术操作技能。 4.2.2熟练掌握组织/细胞培养技术。 4.2.3熟练掌握病理组织学和免疫组织化学技术并具有分析病理组织切片的能力。 4.3采样要求DB 23/T 3067—2024 44.3.1使用的外科手术器械应经过严格消毒、灭菌。 4.3.2样品采集过程保证无菌操作。 5奶牛趾间皮肤外植体构建材料 5.1主要材料 奶牛趾间皮肤外植体构建所用耗材见附录A。 5.2主要设备 奶牛趾间皮肤外植体构建所用主要设备见附录B。 5.3奶牛趾间皮肤外植体构建方法 5.3.1培养基配制 5.3.1.1运输培养基 每100mL运输培养基中，含有青霉素-链霉素-两性霉素B溶液（100×）1mL、L-谷氨酰胺溶液1mL、 5µg/mL硫酸庆大霉素9µL，余量为DMEM/F121:1培养基。 5.3.1.2洗涤培养基 每100mL洗涤培养基中，含有青霉素-链霉素-两性霉素B溶液（100×）1mL、2µg/mL硫酸庆大 霉素4µL，余量为DMEM/F121:1培养基。 5.3.1.3组织培养基 每100mL洗涤培养基中，含有青霉素-链霉素-两性霉素B溶液（100×）1mL、L-谷氨酰胺溶液1mL、 5µg/mL硫酸庆大霉素10µL，胎牛血清10mL，DMEM高糖培养基65.993mL，余量为DMEM/F-121:1培养 基。 5.3.2样本的采集 选取无蹄部疾病且蹄型结构良好的新屠宰奶牛。首先用刷子对蹄部表面进行刷洗，流水冲洗直至表 面无粪便、泥土等污物附着，然后用2%葡萄糖盐酸氯己定冲洗蹄部8～10次，随后用75%酒精擦拭过的电 推剪除去奶牛趾间皮肤被毛，用无菌手术刀片刮净残留毛发，75%酒精喷洗奶牛趾间皮肤8～10次后，使 用8.0mm皮肤打孔器收集奶牛蹄部趾间皮肤。 5.3.3运输 将收集到的奶牛趾间皮肤放入一次性无菌培养皿中，加入含有1%青霉素-链霉素的PBS磷酸缓冲溶液 中，反复洗涤至没有血液后，立即放入装有运输培养基的容器中，随后放入装有冰袋的保温箱中运输回 实验室。 5.3.4奶牛趾间皮肤外植体的组装 5.3.4.1将装有奶牛趾间皮肤的容器放入灭菌后的超净工作台上，取出奶牛趾间皮肤，使用无菌手术 剪去除趾间皮肤多余的皮下脂肪，75%酒精涮洗3次，然后浸入预热至37℃的洗涤培养基中洗涤3次， 每次洗涤时间为15min。DB 23/T 3067—2024 55.3.4.2取500μL体积分数为1.2%的琼脂糖置于12孔培养板最下层作为底座，目的是为奶牛趾间 皮肤外植体提供物理支撑，在其上覆盖0.5cm2无菌手术纱布，将洗涤后的奶牛趾间皮肤置于纱布之上 （图1）。 5.3.4.3在12孔培养板内添加组织培养基至奶牛趾间皮肤的表皮与真皮交界处，形成气相与液相交替 的培养系统。将组装的奶牛趾间皮肤外植体置于37℃、5%CO2湿化培养箱中培养，每12h更换1次 培养基。 5.3.4.4按照本方法组装的奶牛趾间皮肤外植体培养24h时表皮结构完整，真皮层胶原纤维排列紧密， 未见明显病理变化，可用于体外研究，体外模型构建成功。 5.3.5奶牛趾间皮肤外植体活性检测及构建成功的评定方法 奶牛趾间皮肤外植体活性检测及构建成功的评定方法见附录C。 图1皮肤趾间皮肤外植体模型组装图DB 23/T 3067—2024 6AA 附录A （资料性） 奶牛趾间皮肤外植体构建材料 奶牛趾间皮肤外植体构建材料见表A.1。 表A.1奶牛趾间皮肤外植体构建材料 耗材名称 DMEM高糖培养基 DMEM/F121:1培养基 75%医用消毒酒精 无水乙醇 2%葡萄糖盐酸氯己定皮肤消毒剂 PBS磷酸缓冲溶液 青霉素-链霉素溶液 青霉素-链霉素-两性霉素B溶液 L-谷氨酰胺溶液 硫酸庆大霉素溶液 胎牛血清 无菌手术纱布 琼脂糖 无菌手术机械包 一次性无菌培养皿 4%多聚甲醛 苏木素伊红（HE）染色试剂盒 免疫组化染色试剂盒 兔抗牛Caspase-3多克隆抗体 蛋白酶K（不含DNase） 内源性过氧化物酶强力封闭液 TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（显色法）DB 23/T 3067—2024 7BB 附录B （资料性） 奶牛趾间皮肤外植体构建主要设备 奶牛趾间皮肤外植体构建主要设备见表A.2。 表A.2奶牛趾间皮肤外植体构建主要设备 设备名称 超净工作台 -20℃冰箱 电热恒温水浴锅 电热恒温鼓风干燥箱 电热恒温培养箱 CO2湿化培养箱 8.0mm皮肤活检打孔器 12孔细胞培养小室 石蜡切片机 恒温摊片烤片机 光学显微镜