ICS 65.020.20 CCS B 16 黑龙江省地方标 准DB23 DB23/T 3896—2024 玉米穗腐病抗源鉴定及评价技术规程 2024-12-30 发布 2025-01-29 实施 黑龙江省市场监督管理局 发布 DB23/T 3896—2024 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》 的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由黑龙江省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：黑龙江省农业科学院玉米研究所、东北农业大学、中国农业科学院作 物科学研究所。 本文件主要起草人：扈光辉、杨剑飞、朴琳、李永刚、李春辉、李国良、王明泉、付立 新、胡少新、王志国。 DB23/T 3896—2024 3 玉米穗腐病抗源鉴定及评价技术规程 1 范围 本文件规定了玉米穗腐病抗源鉴定及评价技术的接种体制备、 抗病性鉴定圃设置、 接种、 病情调查和抗病性评价等要求。 本文件适用于玉米种质资源对玉米镰孢穗腐病的田间抗性鉴定和评价。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期 的引用文件，仅注日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4404.1 粮食作物种子 第1部分：禾谷类 NY/T 1248.8 玉米抗病虫性鉴定技术规范 第8部分：镰孢穗腐病 DB23/T 2154 玉米机械化籽粒收获栽培技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 玉米穗腐病抗源鉴定 identification of resistanc e source to maize ear rot 利用玉米禾谷镰孢（ Fusarium graminearum ）、拟轮枝镰孢（ F verticillioides ）、亚粘团 镰孢（ F. subglutinans ）、层出镰孢（ F. proliferatum ）穗腐病混合菌进行人工接种，鉴定挖 掘抗穗腐病种质资源。 4 接种体制备 4.1 镰孢病原菌分离与致病力测定 4.1.1 病原菌分离 取发生穗腐病的玉米籽粒，置于 75%的酒精中浸泡 2 s～3 s，取出后置于浓度为 1.5%的 次氯酸钠中浸泡 3 min～5 min，再经无菌水换洗 3次，晾干后用无菌剪刀从中间剪开后将其 中一块组织转移至 PDA平板培养基上，置于 25 ℃～27 ℃环境中，黑暗培养 3 d后挑取病原 菌至试管中保存。 4.1.2 致病力测定 采用根部接种法根据柯赫氏法则验证所分离的镰孢菌为穗腐病原菌， 并确定其具有一定 的致病能力。 DB23/T 3896—2024 4 4.2 镰孢病原菌鉴定 采用形态学和分子生物学技术确定目标病原菌的所属种为禾谷镰孢、拟轮枝镰孢、亚粘 团镰孢、层出镰孢。具体鉴定方法按 NY/T 1248.8 的规定执行。 4.3病原菌的配制 4.3.1 培养基的制备 将高粱粒（ 125 g）在沸水中煮 20 min，然后转移到 250 mL三角瓶中， 121 ℃湿热灭菌 45 min，完成高粱粒培养基的制备。 按照 NY/T 1248.8 提供的方法制备马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ Potato dextrose agar medium，PDA）。 4.3.2 禾谷镰孢孢子悬浮液的配制 将禾谷镰孢转移至 PDA培养基上培养，挑取 3个～ 5个扩繁的禾谷镰孢的菌碟转移到 0.9%～1.5%的无菌盐水中， 每100 mL三角瓶装液量为 15 ml，28 ℃～30 ℃、可见光 150 lx～ 200 lx条件下摇床震荡（ 150 rpm～180 rpm）培养 96 h～120 h，双层纱布过滤后用血球计数 法调整孢子悬浮液浓度为 2×10 6孢子 /mL，4℃条件下可保存 96 h。 4.3.3 拟轮枝镰孢孢子悬浮液的配制 将PDA培养基扩繁 7 d后的拟轮枝镰孢 5个菌碟转移至装有无菌高粱粒的三角瓶中， 并在 26 ℃、避光条件下培养 5 d，每天摇晃一次三角瓶，然后用无菌水冲洗带菌高粱粒，双 层纱布过滤后用血球计数法调整孢子悬浮液浓度为 2×106孢子 /mL，4 ℃条件下可保存 96 h。 4.3.4 亚粘团镰孢孢子悬浮液的配制 将PDA培养基扩繁 7 d后的亚粘团镰孢 5个菌碟转移至装有无菌高粱粒的三角瓶中， 并在 26 ℃、避光条件下培养 5 d，每天摇晃一次三角瓶，然后用无菌水冲洗带菌高粱粒，双 层纱布过滤后用血球计数法调整孢子悬浮液浓度为 2×106孢子 /mL，4 ℃条件下可保存 96 h。 4.3.5 层出镰孢孢子悬浮液的配制 将PDA培养基扩繁 7 d后的层出镰孢 5个菌碟转移至装有无菌高粱粒的三角瓶中，并 在26 ℃、避光条件下培养 5 d，每天摇晃一次三角瓶，然后用无菌水冲洗带菌高粱粒，双层 纱布过滤后用血球计数法调整孢子悬浮液浓度为 2×106孢子 /mL，4 ℃条件下可保存 96 h。 4.3.6 混合孢子悬浮液配制 将禾谷镰孢、拟轮枝镰孢、亚粘团镰孢、层出镰孢按照 4:2:1:0.5 体积比将各镰孢菌孢子 悬浮液混合， 4 ℃条件下可保存 48 h。 5 抗病性鉴定圃设置 5.1 鉴定圃设计 鉴定圃应具有良好的自然发病环境，可根据需要进行排灌。 鉴定种质资源按照晚熟、中熟、早熟 3个熟期分区种植，各熟期内种质资源采取随机排 列，每隔 30行鉴定材料设置 1组已知同熟期抗病、感病对照。对照见附录表 A.1。 DB23/T 3896—2024 5 鉴定材料采用单行区种植， 3次重复，随机排列，小区行长 5 m，行距 0.65 m，植株密度 为75000 株/hm2。 5.2 鉴定材料播种 鉴定材料播种时间与大田播种时间相当， 也可根据当年农业生产气候条件适当调整播种 期。播种时期按 DB23/T 2154 规定执行。 鉴定材料种子不应进行包衣处理，播种方式采用人工点播，每穴点播种子 2粒，出苗后 每穴保留 1株健康的植株。种子符合 GB 4404.1 标准。 5.3 田间管理 田间管理及虫草害防治与大田生产相同，田间管理过程中不应使用杀菌剂。 6 接种 6.1 接种时期 应在玉米雌穗吐丝后 3 d～5 d或花丝长度达 5 cm～10 cm时进行。 6.2 接种部位及方法 接种采用花丝通道法，每株选择上部第 1个果穗，利用可定量的连续注射器，在果穗花 丝通道侧边插入至通道中空部位，每穗注射接种 2 mL孢子悬浮液。 接种后常规田间管理，适度保持田间大气湿度。 7 病情调查 7.1 调查时间 在鉴定材料进入完熟期时进行调查。 7.2 调查方法 采收接种的雌穗，去除苞叶后调查每个接种果穗发病面积，并进行分级统计。病情分级 应按附录表 A.2执行。 记录每份鉴定材料的总株数和各发病级别株数。 8 抗病性评价 8.1 抗病性评价方法 根据不同材料的病情级别，计算每份鉴定材料的平均病情级别，平均病情级别计算公式 见式 1。 ………………………… （式 1） 式中： 𝐸𝑅𝑆𝐴 ൌ（෍𝐸𝑅𝑆 𝑖𝑛 𝑖ൌ1）/𝑛 DB23/T 3896—2024 6 ERSA——穗腐病平均病情级别（ Ear rot score on average ）； ERS i——第 i个接种果穗的病情级别（ Ear rot score ）； i——接种果穗的顺序编码； n——每份鉴定材料的接种果穗总数； 计算保留 1位小数，鉴定材料的抗性评价方法按附录表 A.3执行。 8.2 有效性判别 当感病对照材料抗性鉴定为“感”时，该批次鉴定结果视为有效。 8.3 重复鉴定 当鉴定材料初次鉴定结果表现为“抗”和“高抗”，应在第二年进行重复鉴定。 8.4 抗病性结果判定 对初次鉴定为“抗”以下级别的资源，以当年病情级数作为判定依据；对初次鉴定“抗” 和“高抗”资源，需将初次鉴定结果同重复鉴定结果进行比较，以最高病情级别作为评价结果。 按附录表 A.3的标准进行抗性评价，将调查和评价结果录入附录表 A.4。 9 鉴定档案 应建立鉴定档案，内容包括：病原菌采集、分离、鉴定、接种体的配制、鉴定材料名称、 接种时间、调查时间、接种总株数、各病情级别发病株数和抗病性评价。 DB23/T 3896—2024 附录 A （资料性） A. 1 不同熟期对照表A.1 表A.1 不同熟期对照 熟期 抗病对照 感病对照 晚熟区 X178 B73 中熟区 OH43 W6199Z 早熟区 H3A18200 HRH078 A. 2 玉米穗腐病鉴定田间病情分级表A.2 表A.2 玉米穗腐病鉴定田间病情分级 病情分级 描 述 1 发病面积占果穗总面积 0%～1% 3 发病面积占果穗总面积 2%～10% 5 发病面积占果穗总面积 11%～25% 7 发病面积占果穗总面积 26%～50% 9 发病面积占果穗总面积 51%～100% A. 3 玉米对穗腐病抗性的评价标准表A.3 表A.3 玉米对