达州市市场监督管理局发布四川省（达州市）地方标准 DNA分子标记选育绿壳蛋旧院黑鸡技术规范 TechnicalspecificationsforbreedinggreenshelleggJiuyuanblackchickensusing DNAmolecularmarkersDB5117 DB5117/T100—2024 2024-09-30发布 2024-09-30实施ICS65.020.30 CCSB43DB5117/T100-2024 I前  言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由达州市农业农村局提出并归口。 本文件起草单位：达州市饲草饲料工作站、达州市畜牧技术推广站、达州职业技术学院、西南大 学、万源市畜禽品种改良站、万源市聚源旧院黑鸡养殖专业合作社。 本文件主要起草人：张丹萍、王乙茹、俄广鑫、曾艳、黎纯、蒋旭东、庞金柱、王宇、李祥、何 武亮。DB5117/T100-2024 1DNA分子标记选育绿壳蛋旧院黑鸡技术规范 1范围 本文件规定了DNA分子标记选育绿壳蛋旧院黑鸡的技术要求。 本文件适用于绿壳蛋旧院黑鸡的DNA分子标记选育。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T40188畜禽分子标记辅助育种技术规程 NY/T823家禽生产性能名词术语和度量计算方法 NY/T1673畜禽微卫星DNA遗传多样性检测技术规程 NY/T2695牛遗传缺陷基因检测技术规程 DB5117/T31地理标志产品旧院黑鸡 DB5117/T99旧院黑鸡繁育技术规程 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA分子标记DNAMolecularMarkers DNA分子标记(DNAMolecularMarkers)，是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标 记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。分子标记是生物遗传标记的一种，通过引物设计的不 同，用PCR的方法在生物的基因组DNA上扩增出相关条带，通过电泳、软件识别、分析，可用作生 物遗传信息的研究。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Bp：basepair，碱基对； DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸； PAGE：polyacrylamidegelelectrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳； PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应；DB5117/T100-2024 2Taq酶：Taq-DNApolymerase，耐热DNA聚合酶； ddH2O：双蒸水（超纯水）。 5DNA分子标记选育绿壳蛋旧院黑鸡技术的适用范围 应符合DB5117/T31规定区域内的旧院黑鸡种公鸡和产绿壳蛋旧院黑鸡种母鸡。 6要求 6.1选育技术 6.1.1组建选育基础群 6.1.1.1选择22~30周龄产绿壳蛋种母鸡和性成熟种公鸡组建选育基础群，公母比例1:5~1:8，群体规 模不低于2000只。 6.1.1.2基础群体重、体尺的测定应按照NY/T823的要求执行。 6.1.1.3基础群产蛋性能应符合DB5117/T99的规定。 6.1.1.4基础群外貌特征和生产性能应符合DB5117/T99的规定。 6.1.2基因筛选方法 6.1.2.1样品采集、制备 对基础群个体翅下静脉采血，样品标记，贮存于不高于-20℃容器中送样。 6.1.2.2样品整理核对 对样品编号进行核对，录入相关系统。 6.1.2.3DNA提取 应采用全血DNA提取试剂盒提取基础群个体DNA，提取方法应按照GB/T40188的要求执行。 6.1.2.4DNA浓度和纯度的检测 用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和纯度，检测结果见图1。选留泳道中的DNA样品带 型清晰、整齐，无明显的拖尾现象样品，并用ND-10001紫外分光光度计检测其浓度和纯度，选OD 260/280值均在1.8~2.0的样品，置于-20℃保存。 图1鸡基因组DNA的0.8%琼脂糖凝胶电泳结DB5117/T100-2024 36.1.2.5目标片段筛选 6.1.2.5.1引物序列设计 宜采用PrimerPremier5.0分析设计引物，用引物筛选目标片段应符合表1的要求，扩增片段长度 为364bp和/或190bp。 表1扩增EAV-HP的引物序列信息 引物名称 引物序列（5′→3′） PCRC26830-ins-F GCATTTCACAAACGGGTGTA C26830-ins1-R CCCAGCAGTAAGCCCTACAT C26830-ins2-R CAAAACCACAAAGGTAATGTTCA 6.1.2.5.2扩增目标片段 采用PCR扩增，PCR采用10μL体系：上游引物0.2μL，DNA模板1μL，下游引物各0.1 μL，2×EasyTaqPCRSuperMix（＋dye）5μL，ddH2O补足10μL。PCR扩增程序：95℃预变性 5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。参照 NY/T1673和NY/T2695规定的程序执行。 6.1.2.5.3目标片段PCR产物电泳鉴定 用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。检测目的片段基因型。目的片段大小分别是345bp 和190bp。根据产物条带情况可记录为N/N、LC/N、LC/LC3种基因型。其中LC/N基因型为345bp 和190bp的双条带，N/N基因型为345bp的单条带，LC/LC基因型为190bp的单条带，见图 2。 6.1.3获取绿壳蛋旧院黑鸡种鸡样品 将样品编号与检测到的基因型归档，获得LC/LC基因型个体为纯系绿壳蛋旧院黑鸡种鸡。 图2双重PCR产物凝胶电泳图DB5117/T100-2024 46.2分子标记档案建立 分析世代间的分子遗传结构差异，编写基因选育水平监测报告。 6.3纯系绿壳蛋旧院黑鸡育种 6.3.1核心群组建和繁育 根据筛选出的纯系绿壳蛋旧院黑鸡种鸡组建核心群，母鸡不少于800只，家系不少于80个，每个 家系公母比例为1:10。 核心群繁育应按照DB5117/T99的要求执行。 6.3.2扩繁群组建与繁育 扩繁群母鸡不少于2400只、公鸡不少于120只。 扩繁群的繁育应按照DB5117/T99的要求执行。