DB5117 四川省（达州市）地方标准 DB5117/T94—2024 大球盖菇液体菌种生产技术规程 TechnicalregulationsofliquidspawnculturebyStrophararugosoannulata 2024-04-28发布 2024-05-15实施 达州市市场监督管理局发布ICS65.020.20 CCSB31DB5117/T94-2024 I前  言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由达州市农业科学研究院提出。 本文件由达州市农业农村局归口。 本文件起草单位：达州市农业科学研究院。 本文件主要起草人：赵辉、孙传齐、何雪梅、李彪、王志德、马洁、付亮、赖泉淏、邓力。DB5117/T94-2024 1大球盖菇液体菌种生产技术规程 1范围 本文件规定了大球盖菇液体菌种生产条件、菌种选择、液体菌种生产技术及工艺流程、档案记录与 贮藏等技术。 本文件适用于大球盖菇液体菌种的生产。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB150钢制压力容器 GB5749生活饮用水卫生标准 GB/T12728食用菌术语 GB/T13554高效空气过滤器 GB22207容积式空气压缩机安全要求 GB50073洁净厂房设计规范 NY/T528食用菌菌种生产技术规程 NY5099无公害食品食用菌栽培基质安全技术要求 3术语和定义 GB/T12728界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 大球盖菇liquidspawnofstrophararugosoannulata 别名皱环球盖菇、皱球盖菇、酒红球盖菇、裴氏球盖菇、赤松茸，隶属于担子菌亚门、层菌纲、伞 菌目、球盖菇科、球盖菇属食用菌（strophararugosoannulata）。 3.2 液体菌种liquidspawn 菌丝体及其生长基质组成的液体繁殖材料，包括用于发酵罐菌种扩繁的摇瓶液体菌种、用于代料栽 培发酵罐菌种。 3.3 液体菌种发酵罐cultivationapparatusforliquidspawnDB5117/T94-2024 2也称液体菌种培养罐，进行液体菌种培养的不锈钢专用设备。 3.4 发酵罐空消emptyfermentersterilization 对尚未加水投料的空发酵罐进行高压灭菌。 3.5 发酵罐实消fermentersterilization 对投料后的发酵罐进行高压蒸汽灭菌。 3.6 液体菌种接种器liquidinterfacetrapinoculators 将发酵罐中液体菌种转接到固体培养料的无菌设备。 3.7 接种量inoculationamount 接入发酵罐的菌种数量，以菌种体积与培养基体积的百分比表示。 3.8 终止pHinitialpHvalueofmedium 液体菌种达到放灌指标时的培养基pH。 3.9 放罐emptypot 液体菌种菌丝生长达到生长对数期时，从发酵罐通过传送管在0.15MPa无菌条件下将菌种注射到 固体培养料中。 4生产条件 4.1技术人员 具有食用菌液体菌种生产或检验从业资格证的专业技术人员。 4.2生产环境 4.2.1基本要求 空气优良、地势高燥、交通方便、通风良好、水源电源充足、排水畅通，其中水源应符合GB5749 的规定。 4.2.2环境卫生要求 大球盖菇液体菌种生产场所应有硬质路面、排水良好，远离畜禽养殖场、排污口、工矿业“三废” 及微生物、烟尘和粉尘等污染源。 4.2.3液体菌种生产场所DB5117/T94-2024 3地面应能防水、防腐蚀、防渗漏、防滑，易清洗，应有1.0°~1.5°的排水坡度和良好的排水系统， 排水沟应是圆弧式的明沟。墙壁和天花板应能防潮、防霉、防水、易清洗。 4.3生产设施、设备 4.3.1设施 原料库、配料间、发菌间、冷却间、接种间、培养室、检测室规模配套，布局合理，有调温设施。 设计应符合GB50073的要求。 发菌间应配备水、电（停电需配备发电机)、蒸汽、空气四大动力系统，建立万级局部百级无菌室 净化操作室，保障液体菌种生产。 4.3.2设备 液体菌种培养器、高效空气过滤器、液体菌种接种器、高压蒸汽灭菌锅、蒸汽锅炉、超净工作台、 恒温摇床、恒温培养箱、冰箱、普通光学显微镜、磁力搅拌机、磅秤、天平、酸度计等。其中液体菌种 培养器、高效空气过滤器、高压灭菌锅和蒸汽锅炉应检验合格，符合GB150、GB/T13554、GB22207 的要求。 4.3.3培养基质 应符合NY5099的规定。 5菌种选择 应选用经省级以上非主要农作物品种审定委员会审（认）定或登记（备案）的高产、优质、抗逆性 强、商品性好的品种，菌种生产应符合NY/T528的规定。 6液体菌种生产技术要求 6.1液体菌种生产工艺流程图 液体菌种生产工艺流程图见图1。 图1液体菌种生产工艺流程图 DB5117/T94-2024 46.2生产要求 6.2.1母种制备 应符合NY/T528要求。母种培养基配方：马铃薯（煮汁）200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L， pH自然。 6.2.2摇瓶菌种制备 6.2.2.1培养基配制与分装 按照附录A中A.1的配方配制培养基，用水应符合GB5749的要求。培养基用500ml三角瓶分装， 装量为每瓶150ml~250ml，瓶口用14cm×14cmPP聚丙烯膜封口并用耐高温塑料胶圈扎紧。 6.2.2.2灭菌 123℃、0.14MPa灭菌30min，期间在压力升到0.1MPa时，打开放气阀排尽冷空气。灭菌结束后， 自然焖锅降压，防止培养基外溢。 6.2.2.3冷却 将灭菌后的液体培养基放入超净工作台中，冷却至20℃~25℃。 6.2.2.4接种 在无菌条件下，严格按无菌操作要求接种。用接种针挑取5~6块3mm~5mm的母种块迅速转接于 摇瓶培养基内，每支母种接5瓶~7瓶，接种后及时贴好标签。 6.2.2.5培养 接种前2d，用臭氧发生器和75%酒精分别对培养室及培养器消毒。接种后放入25℃恒温箱中静置 培养ld，后置于恒温摇床上培养，温度控制在25℃~28℃，转速140r/min~160r/min，培养时间6d~7d 至菌液出现直径3mm~5mm均匀菌丝球。期间每天观察，及时去除污染菌种。 6.2.3液体菌种制备 6.2.3.1投料前准备 检查罐上全部阀门、安全阀、压力表，要求完好、工作正常。对罐内、外和全部阀门用流水冲洗， 达到无死角、内壁无任何残留物。在发酵罐中加入适量的水（距离观察窗下边缘5cm左右)，完全打开 罐体上排气阀门，将排气管接入下水管道，将无菌空气接入发酵罐底部的进气口，通入无菌空气，让进 气气压表维持0.01Mpa。 6.2.3.2培养基制备 应符合NY/T528、GB5749要求。培养基配方见附录A中A.2，其中黄豆粉、玉米粉需过直径0.15 mm的孔筛。 6.2.3.3煮罐和空消 培养器初次使用、出现杂菌、长期放置、更换品种时，都要在121℃、0.12MPa下灭菌40min进 行煮罐和空消。 6.2.3.4投料和定容 将附录A中A.2的原材料用温水溶解后倒入发酵罐中。加水定容至所需体积，培养基投料量为罐 体总容积的70%，加入0.03%消泡剂后清理加料口至无残留物料，拧紧上料口盖。 6.2.3.5气动搅拌