ICS 11.020 C 55 WS 中 华 人 民 共 和 国 卫生行 业 标 准 WS/T 553—2017 人群维生素 A缺乏筛查方法 Method for Vitamin A deficiency screening 2017 - 08 - 01发布 2018 - 02 - 01实施 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 发布 WS/T 553—2017 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 -2009给出的规则起草。 本标准主要起草单位：中国疾病预防控制中心营养与健康所、首都儿科研究所、北京大学医学部公 共卫生学院、浙江省疾病预防控制中心。 本标准主要起草人：霍军生、朴玮、丁钢强、孙静、黄建、王丽娟、唐艳斌、陈頔、李瑾、高洁、 张霆、林晓明、李可基、章荣华。 WS/T 553—2017 1 人群维生素 A缺乏筛查方法 1 范围 本标准规定了 人群维生素A缺乏筛查的指标、检测方法及相应的维生素 A缺乏的判定界值。 本标准适用于人群维生素 A缺乏的判定，个体维生素 A缺乏的临床诊断需要结合临床。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 WS/T 225 临床化学检 验血液标本的收集与处理 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 维生素 A vitamin A 视黄醇 retinol 紫萝酮衍生物的总称。一种脂溶性维生素 。有维生素 A1及维生素 A2两种 3.2 维生素A缺乏 vitamin A deficiency 人体内维生素 A水平不足以维持正常生理 功能，血清（血浆）中视黄醇水平儿童（ 6岁及以下）低于 0.35µ mol/L，6岁以上儿童及成人低于 0.70 µ mol/L，并可能出现眼、皮肤 等的病理改变。 3.3 维生素A边缘型缺乏 marginal vitamin A def iciency 人体内维生素 A水平可以维持正常生理功能，但是补充维生素 A后血清 （血浆） 中视黄醇水平上升 。 4 人群维生素A边缘型缺乏和缺乏判定标准 以单位体积血清（血浆）视黄醇含量作为维生素 A缺乏筛查指标，当实测的血清（血浆）视黄醇含 量小于相应参考值时，即判定为相应维生素 A边缘型缺乏或者缺乏 ，判定指标及判定界值 见表1。 WS/T 553—2017 2 表1 人群维生素 A边缘型缺乏和缺乏的判定指标及判定界值 维生素A状况 血清（血浆）视黄醇含量 边缘型缺乏/（µmol/L）或(µg／mL） 缺乏/（µmol/L）或（ µg／mL） 儿童（6岁及以下） ≥0.35～＜0.70， ≥0.10～＜0.20 ＜0.35， ＜0.10 6岁以上儿童及成人 ≥0.70～＜1.05， ≥0.20～＜0.30 ＜0.70， ＜0.20 注：转换系数 1mol视黄醇= 286.45 g 视黄醇。 5 人群维生素A缺乏公共卫生问题等级判定 标准 在1岁及以上被评估人群中，计算血清（血浆）视黄醇含 量＜0.70 µ mol/L 人数比例，根据维生素 A 缺乏公共卫生问题判定标准 对该人群的维生素 A缺乏的公共卫生问题严重程度进行判定。判定问题等级 及判定值见表 2。 表2 维生素A缺乏公共卫生问题判定标准 公共卫生问题等级 流行率 轻度 ≥2%～≤10% 中度 ＞10%～＜20% 重度 ≥20% 注1：适用于年龄 ≥1岁人群。 注2：维生素 A缺乏判定标准 ＜0.70 µmol/L 6 血清（血浆） 维生素A测定方法 按附录A规定的血清（血浆）视黄醇测定方法 -高效液相色谱法（ HPLC）进行测定。 WS/T 553—2017 3 A A 附 录 A （规范性附录） 血清（血浆）视黄醇测定方法 -高效液相色谱法（ HPLC） A.1 原理 血清（血浆）中加入内标视黄醇醋酸酯，经正己烷萃取处理，使用高效液相色谱 C18反向柱进行分 离后，经紫外检测器 进行定量检测。 A.2 试剂和材料 除非另有规定，本方法所用均为 色谱纯试剂和蒸馏水或相当纯度的水（ H2O）。 A.2.1无水乙醇（C2H6O）。 A.2.2甲醇（CH4O）。 A.2.3正己烷（C6H14）。 A.2.4硝酸（HNO3）。 A.2.5视黄醇标准品（C20H30O）。 A.2.6视黄醇醋酸酯标准品（ C22H32O2 ）。 A.2.7高纯氮气（N2）。 A.3 仪器 A.3.1高效液相色谱仪 带紫外分光检测器。 A.3.2氮吹仪。 A.3.3离心机：转速 ≥5000 r/min。 A.3.4天平：感量为 0.1 mg。 A.3.5紫外分光光度计。 A.4 样本采集和保存 参照WS/T 225 进行静脉血采集 、血清（血浆）分离和 血样的保存。 注：血样的采集和前期处理均须在避光或红光环境下进行，以免血样中视黄醇的含量发生变化。 A.5 分析步骤 A.5.1 视黄醇标准品储备液的配制 A.5.1.1 取一定量的视黄醇标准品，放入 10 mL容量瓶中，用少量无水乙醇充分溶解后定容至 10 mL，制 成视黄醇标准品储备液。 A.5.1.2 吸取100 µL视黄醇标准品储备液， 置于 10 mL容量瓶中， 加入无水乙醇定容到 10 mL（重复两次） 。 WS/T 553—2017 4 A.5.1.3 采用紫外分光光度计于 325 nm波长处，检测视黄醇标准品储备 液的含量，空白试剂为无水乙 醇。用比吸光系数计算出 标准储备液中 视黄醇的浓度。 A.5.1.4 储备液中视黄醇含量按式 (A.1)计算。 V10 10.00 1001 EAC3 1 .............................. (A.1) 式中： C1—视黄醇标准品储备液 浓度，单位为毫克每毫升（ mg/mL）； A—视黄醇的平均紫外吸光值 ； E—视黄醇的1 %比吸光系数（视黄醇为 1835）； V—加入标准 品储备液的量， 单位为微升（ mL）； 10.00—标准品储备液最终稀释体积，单位为毫升（ mL）。 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 注1：视黄醇标准 品储备液须 -20℃以下避光储存 ，临用前需用紫外分光光度法标定其准确浓度 。 注2：配制所用的所有容器均经硝酸 浸泡 24h，并完全洗净晾干。 A.5.2 视黄醇醋酸酯内标的配制 A.5.2.1 采用感量为0.1 mg天平，准确称量视黄醇醋酸酯标准品 82.0 mg，倒入10 mL容量瓶中，无水乙 醇充分溶解后定容至 10 mL，配制成视黄醇醋酸酯内标浓溶液。 A.5.2.2 使用高效液相色谱仪 ，在325 nm处检测视黄 醇醋酸酯内标浓溶液的峰面积后，用无水乙醇稀 释至浓度约为 6 µg/mL的视黄醇醋酸酯内标工作 溶液。 A.5.3 标准曲线的绘制 A.5.3.1 视黄醇标准曲线的配制 分别吸取标定的视黄醇标准储备液置于 10 mL棕色容量瓶中 ,再加入等体积视黄醇醋酸酯内标工作 液置于棕色容量瓶中 , 用无水乙醇稀释至刻度， 使视黄醇标准液的浓度分别为 1.00 µg/mL，0.50 µg/mL， 0.30 µg/mL，0.20 µg/mL，0.10 µg/mL和0.05 µg/mL。待测，上机。 注：所有标准品均保存于 -20˚C低温冰箱中。 A.5.3.2 高效液相色谱参考条件 高效液相色谱参考条件应符合如下要求： ——预柱：4.0 mm×4.5 cm，10 µm。 ——分析柱：C18柱，4.6 mm×25.0 cm，5 µm。 ——流动相：甲醇：水 =98：2。流动相使用前充分混匀，并在临用前脱气 。 ——流速：1 mL/min。 ——检测波长 ：325 nm。 ——柱温：28℃±1℃。 ——进样量：20 µL。 A.5.3.3 视黄醇标准曲线的绘制 WS/T 553—2017 5 分别取视黄醇标准系列溶液由低至高进行测定，每次测定均加入与标准品中内标浓度相同的视黄 醇醋酸酯内标进行测定。以视黄醇标准系列溶液浓度为横坐标 , 以视黄醇峰面积与视黄醇醋酸酯内标 的峰面积之比 为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归（ r2 ≥ 0.999）。内标测定两个平行样。 A.5.4 血样中视黄醇的测定 A.5.4.1 冻存血清（血浆）血样需要在室温，避光条件下进行自然解冻，并震荡混匀。新鲜血清（血 浆）血样可直接进行下一步操作。 A.5.4.2 吸取血清（血浆）和内标各 100 µL至1.5 mL离心管中，振荡混匀 30 s，加1 mL正己烷萃取，振 荡1min。 A.5.4.3 5000 r/min下离心5 min，取出后吸取上清液 800 µL至另一1.5 mL离心管中。 A.5.4.4 氮气吹干后加入 200 µL乙醇溶解，振荡混匀 30 s，离心5 min，5000 r/min。 A.5.4.5 吸取150 µL样本溶液，使用高效液相色谱仪进行检测。根据色谱图中样品视黄醇的峰面积