ICS 11.020 C 05 WS 中华人民共和国 卫生行业 标准 WS/T 594—2018 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱 酯酶等位基因检测 法 Test methods of fly resistance to insecticides -A molecular method for detecting insensitive ace allel e in the Musca domestica 2018 - 03 - 01发布 2018 - 08 - 01实施 中国人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布 WS/T 594—2018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 —2009给出的规则起草。 本标准主要起草单位：中国科学院动物研究所、北京市疾病预防控制中心、扬州大学、中国疾病预 防控制中心传染病预防控制所、中国农业大学、中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行 病研究所、上海市疾病预防控制中心。 本标准主要起草人 ：邱星辉、李梅、曾晓芃、钱坤、周小洁、李静、刘起勇、高希武、赵彤言、冷 培恩。 WS/T 594—2018 1 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法 1 范围 本标准规定了家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因的检测方法。 本标准适用于家蝇乙酰胆碱酯酶第 342氨基酸位点基因型的检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 乙酰胆碱酯酶 acetyl cholinesterase 存在于生物体的一种水解酶，由乙酰胆碱酯酶基因 ace编码。 2.2 等位基因 allele 存在于同一物种的相同基因的不同形式互称为等位基因。 2.3 342G、342V 和 342A 342G、342V和342A分别表示家蝇乙酰胆碱酯酶第 342氨基酸残基位点上的氨基酸为 甘氨酸（ Gly）、 缬氨酸（ Val）和丙氨酸（ Ala）。 3 样本采集 采用诱捕或网捕等方法从现场采集家蝇成虫内，浸泡在 100%乙醇溶液中带回实验室。浸泡样品可在 4 ℃条件下短期（ 6个月内）保存，可在 -20 ℃以下长期保存。 4 引物 引物F的序列为 CGGTGCATTTGGGTTTCTAC ，引物R的序列为 CGTAACCGCTAAGATCTGCTG 。引物设计参照 附 录A。配制为10 μmol/L浓度，保存于 -20 ℃冰柜。 5 仪器设备 5.1 PCR（聚合酶链式反应） 仪。 5.2 琼脂糖凝胶电泳仪。 WS/T 594—2018 2 5.3 凝胶成像仪。 5.4 恒温水浴锅。 6 主要试剂 6.1 DNA聚合酶（ Taq酶）。 6.2 限制性内切酶 Bsp1286I 。 6.3 限制性内切酶 Eae I。 7 操作步骤 7.1 在PCR管中加入 10×PCR 缓冲液 (含100 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCl2) 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL，引物F 0.5 μL，引物R 0.5 μL，单头家蝇的基因组 DNA 1 μL （100 ng～300 ng，提取方法可参见附录 B，也可用商售的 DNA提取试剂盒或其 他类似方法提取）和 Taq 酶 (2～5个单位)，用灭菌水补齐至 25 μL，混匀。 7.2 将PCR管放入PCR 仪中，设置 PCR反应程序为： 94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环； 72 ℃ 10 min。运行程序。 7.3 PCR运行结束后，取 5 μL PCR产物在1.5% 的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压设定在 160 V，电泳 20 min后在紫外光下检测，有清楚单一的 609bp的条带的 PCR产物用于进行以下酶切反应。 7.4 取合格样品（即电泳检测产物为 609bp）的PCR产物设置两个酶切反应，反应 A 用Bsp1286I 酶、 反应B用Eae I酶进行酶切，酶切反应体系的设置根据酶产品的使用说明进行（参见附录 C）。 7.5 将酶切后的产物上样在 1.5% 的琼脂糖凝胶上，电压设定在 160 V，电泳20 min后在紫外光下检 测。 8 基因型确定 根据酶切产物的电泳 结果（参见附录 D），确定家蝇个体的乙酰胆碱酯酶的基因型 ，见表 1。 表1 家蝇个体乙酰胆碱酯酶的基因型确定 反应 I ( 加Bsp1286I酶切) 反应II (加Eae I酶切) 乙酰胆碱酯酶 342氨基酸位点基因型 361bp 、248bp 609bp 敏感型纯合子 （G/G） 609bp 609bp 不敏感 I型纯合子（ V/V） 609bp 361bp、248bp 不敏感II型纯合子（ A/A） 609bp、361bp、248bp 609bp 不敏感 I型/敏感型杂合子（ G/V） 609bp、361bp、248bp 609bp、361bp、248bp 不敏感II型/敏感型杂 合子 （G/A ） 609bp 609bp、361bp、248bp 不敏感I型/不敏感II型杂合子（ V/A ） 注： G表示氨基酸残基为 Gly（甘氨酸） ； V表示氨基酸残基为 Val（缬氨酸） ；A表示氨基酸残基为 Aal（丙 氨酸） 。 WS/T 594—2018 3 A A 附 录 A （资料性附录） 引物设计参照序列 342V CGGTGCATTTGGGTTTCTAC ATCTTTCACCGGTTATGCCAGGTTTTGAAGAAGAAGCTCC 342A CGGTGCATTTGGGTTTCTAC ATCTTTCACCGGTTATGCCAGGTTTTGAAGAAGAAGCTCC 342G CGGTGCATTTGGGTTTCTAC ATCTTTCACCGGTTATGCCAGGTTTTGAAGAAGAAGCTCC 342V CGGCAACGTGGGTCTTTGGGATCAGGCCTTGGCCTTGCGTTGGCTGAAGGAGAATGCCCG 342A CGGCAACGTGGGCCTCTGGGATCAGGCCTTGGCCTTGCGTTGGCTTAAG GAGAATGCCCG 342G CGGCAACGTGGGCCTTTGGGATCAGGCCTTGGCCTTGCGTTGGCTGAAGGAGAATGCCCG 342V TGCATTTGGCGGCAATCCGGAATGGATGACGCTGTTTGGTGAATCGGCTGGTTCGAGTTC 342A TGCATTTGGCGGCAATCCGGAATGGATGACGCTGTTTGGTGAATCGGCTGGTTCGAGTTC 342G TGCATTTGGCGGCGATCCCGAATGGATGACGCTGTTTGGTGAATCGGCTGGTTCGAGTTC 342V CGTGAATGCTCAACTGATGTCGCCGGTAACGCGTGGCCTGGTCAAACGTGGTATGATGCA 342A CGTGAATGCTCAACTGATGTCGCCGGTAACGCGTGGCCTGGTCAAACGTGGCATGATGCA 342G CGTGAATGCTCAACTGATGT CGCCGGTAACGCGTGGCCTTGTCAAACGTGGCATGATGCA 342V GTCG GTCACAATGAATGCTCCCTGGAGCCACATGACATCAGAGAAGGCGGTTGAAATTGG 342A GTCG GCCACAATGAATGCTCCCTGGAGCCACATGACATCAGAGAAGGCGGTTGAAATTGG 342G GTCG GGCACAATGAATGCTCCCTGGAGCCACATGACATCAGAGA AGGCGGTTGAAATTGG 342V TAAAGCTTTGGTAAATGACTGTAACTGTAATGCCTCATTGTTACCGGTAAGCAGTGGAGT 342A TAAAGCTTTGGTAAATGACTGTAACTGTAATGCCTCATTGTTACCGGTAAGCAGTGGAGT 342G TAAAGCTTTGGTAAATGACTGTAACTGTAATGCCTCATTGTTACCGGTAAGCAGTGGAGT 342V ATTTATGCGACTATACGAATTTTTCTTTGCTGATGAATTTTATTTTCCTCTTTTTTGTGT 342A ATTTATGCGACTATACGAATTTTTCTTTGCTGATGAATTTTATTTTCCTCTTTTTTGTGT 342G