ICS 13.100 C 60 ws 中 华 人 民 共 和 国 卫生行 业 标 准 WS/T 615—2018 辐射生物剂量估算 早熟染色体凝集 环分析 法 Estimation of radiati on biological dose —analyzing premature chromosome condensation ring 2018 - 06 - 15发布 2018 - 12 - 01实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会 发布 WS/T 615—2018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家卫生标准委员会放射卫生标准专业委员会提出。 本标准起草单位： 中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所、中国医学科学院放射医学研究 所、苏州大学。 本标准主要 起草人： 刘青杰、赵骅、陆雪、刘强、朱巍。 WS/T 615—2018 1 辐射生物剂量估算 早熟染色体凝集环 分析法 1 范围 本标准规定了通过分析早熟染色体凝集环，对电离辐射外照射受照人员进行生物剂量估算的方法。 本标准适用于发生在受照后 1个月内、吸收剂量在 4 Gy～20 Gy范围内的X或γ射线、急性全身均匀 或近似均匀 外照射的受照人员的生物剂量估算。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 28236一2011 染色体畸变估算生物剂量 方法 3 术语和定义 GB/T 28236 一2011界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 早熟染色体凝集 premature chromosome condensation ；PCC 利用化学或生物的方法，间期 淋巴细胞核被诱导提前进入有丝分裂期，使间期 淋巴细胞核内极度分 散状态的染色 质凝缩成细纤维状的染色体样结构。 3.2 早熟染色体凝集环 premature chromosome condensation ring ；PCC-R 当早熟染色体凝集断裂后， 一条染色体的两个断裂末端重接形成 的环状染色体。 3.3 剂量-效应曲线 dose-effect curve 某种生物体系受到照射后的反应与受照射剂量之间存在着某种定量关系，可用适当的数学模式 描 述，制备出相应的反应效应与受照剂量之间关系的刻度曲线，可用其估算受照剂量。 4 早熟染色体凝集标本制备 4.1 主要仪器和试剂配制 主要仪器和试剂配制参见附录 A。 4.2 早熟染色体凝集标本制备 WS/T 615—2018 2 4.2.1 样品采集 抽取人静脉血 1 mL～2 mL，注入肝素抗凝管。 4.2.2 样品接种和细胞培养 将0.5 mL肝素抗凝全血加入到 4.5 mL含有20%胎牛血清的全培养基（ RPMI 1640 ）中，每个样品设 2 个平行样， 37℃恒温培养箱中 培养46 h～47 h后，加入终 浓度为50 nmol/L 的花萼海绵体诱癌素 A （Calyculin A ）或终浓度为 500 nmol/L 的冈田酸 （Okadaic acid ），继续培养 1 h～2 h。 4.2.3 收获细胞 用吸管吹打培养物，转入 15 mL刻度离心管中，水平离心机 250 g离心10 min，弃上清液 ，约留1 mL 剩余沉淀物。 4.2.4 低渗 每离心管中加入 37℃预温的 0.075 mol/L 氯化钾（ KCl）至8 mL～10 mL，用吸管吹打均匀，置 37℃ 低渗10 min～30 min。 4.2.5 预固定 每离心管中加入 1 mL～2 mL新配制的固定液 [甲醇/冰乙酸 = 3/1（体积比） ]，用吸管轻轻吹吸混 匀，250 g离心10 min，弃上清液 。 4.2.6 固定 每离心管中加入 8 mL固定液，轻轻吹吸混匀，室温固定 20 min，250 g离心10 min，弃上清液 。 4.2.7 第二次固定 加入8 mL固定液，轻轻 吹吸混匀， 室温固定15 min，250 g离心10 min，弃去大部分上清 液，留适 量上清液。 4.2.8 细胞悬液的制备 用吸管吹打混匀剩余上清 液和沉淀，制得细胞悬液。 4.2.9 制片 将2滴～3滴细胞悬液滴在预冷玻片上，过火 2 s～3 s，室温自然干燥。 4.2.10 染色 用pH 6.8的磷酸缓冲液将 吉姆萨染液（ Giemsa）稀释成8%溶液，染色8 min ～10 min，自来水冲洗 后晾干。 5 早熟染色体凝集 环的分析和记录 5.1 光学显微阅片 在光学显微镜的低倍镜 （10倍）下，寻找合适的早熟染色体凝集分裂相；然后 在油镜（ 100倍） 下将早熟染色体凝集 分裂相调至视野正中间，计数早熟染色体凝集环的数量。 WS/T 615—2018 3 5.2 早熟染色体凝集环判定标准及计数标准 早熟染色体凝集环分为空心环和实心环。空心环是 呈中空的圆环形或不规则环形结构 。实心环是呈 实心球状的结构，稍致密，直径 大于早熟凝集染色单体的横径。在分析时不计数实心环。早熟染色体凝 集环示例参见附录 B。 两条姐妹染色单体排在一起的分裂相称作 G2/M期早熟染色体凝集分裂相， 这种分裂相中出现的环称 作G2/M期早熟染色体凝集环。 G2/M期早熟染色体凝集分裂相中排在一起的 2个大小相近的环状结构，计 数1个早熟染色体凝集环。 两条染色单体 明显处于分开状态的分裂相称作 M/A期早熟染色体凝集分裂相， 这种分裂相中出现的环称作 M/A期早熟染色体凝集环。 M/A期早熟染色体凝集分裂相中的每个环状结构， 计数1个早熟染色体凝集环。 5.3 结果数据的记录和保存 检测到早熟染色体凝集环时，需要进行拍照。 将选择分析的每一个 早熟染色体凝集 分裂相记录在早 熟染色体凝集环分析 记录表中。早熟染色体凝集环分析记录表参见附录 C。 6 剂量-效应曲线的建立 6.1 样品采集 抽取人静脉血 6 mL～8 mL，注入肝素抗凝管。 6.2 供血者要求 2名～3名健康成年人 ，非放射工作者，男女均可，年龄在 18岁～60岁，半年内无急慢性疾病、无射 线和化学毒物接触史，近一个月内无病毒感染史。 6.3 照射条件 样品均匀照射； X或γ射线照射剂量范围在 4 Gy～20 Gy；照射剂量率选择 0.3 Gy/min ～1 Gy/min ， 照射剂量点在 6个～8个（均匀布点）； 37℃进行照射。照射后将样品置 37℃恒温培养箱中 修复2 h，然 后进行细胞培养。 6.4 早熟染色体凝集标本制备、分析及记录 早熟染色体凝集标本制备、分析和记录按照第 4章～第5章中所述方法进行。 6.5 数据处理 两组间早熟染色体凝集环每细胞数的比较用泊松分布的 U检验，多组间早熟染色体凝集 环每细胞数 的比较用卡方检验；早熟染色体凝集环每细胞数与照射剂量的关系进行曲线拟合，对拟合回归方程进行 假设检验用卡方检验。 6.6 剂量-效应曲线拟合 参照GB/T 28236 -2011中4.3，对X或γ射线诱导的早熟染色体凝集环与受照射剂量之间的剂量 -效应 关系以拟合二次多项式为宜，按照式（ 1）进行拟合： Y = c + D + D2 ………………………………………… （1） 式中： Y —— 早熟染色体凝集环每细胞数； WS/T 615—2018 4 c —— 常数项， 早熟染色体凝集环每细胞数本底值（ PCC环/分裂相）；  —— 剂量一次项系数； D —— 照射剂量，单位为戈瑞（ Gy）；  —— 剂量二次项系数。 6.7 建立剂量 -效应曲线 进行剂量估算的实验室应建立剂量 -效应曲线；有条件的实验室可建立不同辐射类型、不同剂量率 的剂量-效应曲线。 7 剂量估算 7.1 早熟染色体凝集标本的制备 所要估算剂量样品的早熟染色体凝集标本制备方法均应与建立剂量 -效应曲线的方法相同。 7.2 分析早熟染色体凝集分裂相数的确定 可先分析 200个早熟染色体凝集分裂相，将得到的早熟染色体凝集环每细胞数 p，代入式（ 2）计算 出需要分析的分裂相数。 n = (1 ) 96.04p p …………… ……………………………（ 2） 式中： n —— 需要分析的分裂相数； p —— 早熟染色体凝集环每细胞数； 96.04 —— 采用20%的允许误差，令 1.96 n)-(1p p =p×20%，根据95%可信区间计算获得的常数。 7.3 检测早熟染色体凝集环每细胞数和 95%可信区间的计算 检测早熟染色体凝集环每细胞数的计算按照式（ 3）计算： p = x n ………………………………………………………（ 3） 式中： p —— 检测到的早熟染色体凝集环每细胞数； x —— 检测到的早熟染色体凝集环数； n —— 早熟染色体凝集分裂相数 。 检测早熟染色体凝集环每细胞数的 95%可信区间按照式 （4）计算： 95%CI = p  1.96Sp …………