ICS 11.020 C 6 1 WS 中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准 WS /T 630 — 2018 日本血吸虫抗体检测 间接红细胞凝集试验 Detection of antibody against Schistosoma japonicum — Indirect haemagglutination test 2018 - 09 - 26 发布 2019 - 04 - 01 实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会 发 布WS /T 628 — 2018 I 前    言 本标准按照 GB/T 1.1 — 2009 给出的规则起草。 本标准由国家卫生标准委员会寄生虫病标准专业委员会提出。 本标准起草单位 ： 安徽省血吸虫病防治研究所 、 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 、 浙江 省医学科学院寄生虫病研究所、江苏省血吸虫病防治研究所、江西省寄生虫病防治研究所。 本标准主要起草人：张世清、汪天平、许静、闻礼永、章乐生、郑彬、熊彦红、梁幼生、林丹丹 。WS/T 628 — 2018 1 日本血吸虫抗体检测 间接红细胞凝集试验 1 范围 本标准规定了 检测日本血吸虫抗体的 间接 红细胞凝集试验 。 本标准适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构 对 人体血清中日本血吸虫抗体 的检测 。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 血吸虫病 schistosomiasis 由血吸虫寄生于人和其 他 哺乳动物所引起的疾病，在我国特指日本血吸虫病（ schistosomiasis japonica ）。 注：改写 GB 15976 — 2015 ，定义 3.1 2.2 间接红细胞凝 集试验 indirect haemagglutination test 将 抗原 包被于红细胞表面 ， 成为致敏的载体 ， 然后与相应的抗体结合 ， 通过抗体桥联 ， 出现肉眼可 见的凝集现象，以检测样本中的相应抗体。最常 用的红细胞为健康人 “ O ” 型红细胞。 2.3 可溶性虫卵抗原 soluble egg antigen 血吸虫虫卵经匀浆和超声破碎等处理后离心收集的上清液 ， 含蛋白质 、 糖蛋白 、 多糖等多种成分复 合物。 3 仪器设备 3.1 台式低速离心机 最高转速 ≥ 2 500 r/min ，或最大相对离心力 ≥ 8 00 g 。 3.2 平板微量振荡器 最高振动频率 2 800 r/min ，最大振幅 6 mm 。 3.3 电热恒温水浴箱 控温范围 室温 + 5 ℃ ～ 99.9 ℃ ，温度分辨率 / 波动度 0.1 ℃ / ± 0.5 ℃ 。WS /T 628 — 2018 2 3.4 微量移液器 量程范围 10 μ L ～ 100 μ L ，增量 1 μ L ；量程范围 10 0 μ L ～ 1 000 μ L ，增量 5 μ L 。 4 试剂材料 4.1 冻干致敏红细胞 主要组成成分为日本血吸虫可溶性虫卵抗原、健康人 “ O ” 型红细胞和蔗糖， 制备方法 参见附录 A 。 4.2 阳性对照血清 感染日本血吸虫的兔混合血清，参见附录 A 。 4.3 阴性对照血清 正常兔混合血清，参见附录 A 。 4.4 稀释液 pH7.2 磷酸盐缓冲液（ PBS ），参见附录 A 。 4.5 血凝反应板 “ V ” 型微孔有机玻璃血凝板为宜， 操作程序 参见附录 B 。 5 检测步骤 5.1 样本准备 采集末梢血 100 μ L 或静脉血 2 mL ，室温下放置至血块收缩后， 800 g 离心 5 min ，分离出血清后进 行检测，参见附录 B 。 5.2 样本检测 5.2.1 待测样本编号，从左到右按 1 ～ n 号依次排列。 5.2.2 阴性对照血清 、 阳性对照血清各加 100 μ L 稀释液 ， 使其充分溶解 ， 移液器吹打数次混匀后备用 。 5.2.3 取血凝反应板 ， 横向平放纵向使用 。 于第 1 列第 1 孔加稀释液 100 μ L ， 第 1 列的第 3 、 4 孔各加 稀释液 25 μ L ，第 2 孔不加稀释液。 5.2.4 于第 1 列第 1 孔加 1 号待测样本 25 μ L ， 充分混匀后吸出 25 μ L 至第 2 孔 ， 再从第 1 孔吸出 25 μ L 至第 3 孔，充分混匀后吸出 25 μ L 至第 4 孔，充分混匀后吸出 25 μ L 弃去。 5.2.5 同上操作，依次进行第 2 ～ n 号样本、阴性对照血清、阳性对照血清的倍比稀释，血凝反应板纵 向 4 孔的血清稀释度依次为 1 ： 5 、 1 ： 5 、 1 ： 10 、 1 ： 20 。 5.2.6 每支冻干致敏红细胞加 1 mL 稀释液，充分混匀后备用。 5.2.7 除每列第 1 孔血清稀释孔外 ， 其余血清稀释孔各加致敏红细胞悬液 25 μ L ， 血凝反应板置微量振 荡器震摇 1 min ～ 2 min ， 封板并置 37 ℃ 电热恒温水浴箱 30 min ， 在白色背景下观察结果 ， 参见附录 B 。WS /T 628 — 2018 3 6 结果判定 6.1 结果判定标准见附录 C 。阴性对照血清不出现凝集现象，阳性对照血清出现凝集现象，检测结果 视为有效。 6.2 以呈 “ ＋ ” 或以上反应强度凝集的血清最高稀释度作为血清的效价，以效价 ≥ 1 ： 10 作为阳性判断标 准。WS /T 628 — 2018 4 A A 附 录 A （资料性附录） 主要试剂材料制备方法 A.1 冻干致敏红细胞 A.1.1 可溶性虫卵抗原 取冻干虫卵 ， 0.01% 硫柳汞生理盐水配制悬液 ， 组织匀浆器研磨并置 ﹣ 20 ℃ 反复冻融 3 次 ， 10 000 g 离心 30 min ，取上清液。测定蛋白含量后，用硫柳汞生理盐水稀释至 0.75 mg/mL ，分装到西林瓶，置 ﹣ 20 ℃ 保存备用。 A.1.2 醛化红细胞 A.1.2.1 取健康人 “ O ” 型红细胞 ， 用生理盐水洗涤 3 次 ， 移入刻度离心管 ， 800 g 离心 10 min ， 记录压 积红细胞体积。 A.1.2.2 取压积红细胞 ， 每 1 mL 加 pH 7.2PBS 25 mL 混匀 ， 再缓慢滴加 2.5% 戊二醛 2 mL ， 边滴边摇 。 室温摇荡 1 h ， PBS 洗涤 3 次 ， 再用蒸馏水洗涤 2 次 。 最后用 0.01% 硫柳汞生理盐水配成 10% 醛化红细胞悬 液，置 2 ℃ ～ 8 ℃ 备用。 A.1.3 鞣化红细胞 A.1.3.1 配制含 0.01% 鞣酸的生理盐水，与等量的 0.1 mol/L pH 7.2PBS 混匀。 A.1.3.2 取压积醛化红细胞倒入上述溶液中配成 1% 浓度，置 37 ℃ 恒温水浴振荡器中振摇 15 min ， 用 pH 7.2PBS 洗涤 3 次。 A.1.3.3 将洗涤后的红细胞倒入 0.1 mol/L pH 6.4PBS 溶液中配成 1% 浓度，充分混匀，即为鞣化红细 胞。 A.1.4 致敏红细胞悬液 A.1.4.1 鞣化红细胞悬液中加入终浓度为 0.25% 的可溶性虫卵抗原 ， 充分混匀 ， 置 37 ℃ 恒温水浴振荡 器中振摇 45 min 致敏。 A.1.4.2 离心沉淀弃去上清液 ， 以含 1% 正常兔血清 （ 经 56 ℃ 灭活 30 min 后的血清 ） 的 pH 7.2PBS 洗 涤沉淀以去除未结合的可溶性抗原，再以含 1% 正常兔血清的 pH 7.2PBS 配制 4% 浓度致敏红细胞悬液 。 A.1.5 冻干致敏红细胞 在致敏红细胞悬液中加入蔗糖（ 10% 终浓度）和正常兔血清（ 2% 终浓度）。摇匀后分装于 2 mL 的 安瓿瓶内 ， 每支 0.5 mL 。 将分装后的致敏红细胞放入冷冻干燥机内进行冻干 ， 并用封口机进行封口 。 冻 干致敏红细胞外观为褐色或淡红色疏松体 ， 间接血凝法测定阳性对照血清效价不低于 1 ： 640 ， 测定阴性 对照血清效价不高于 1 ： 5 。 A.2 阳性对照血清WS /T 628 — 2018 5 选择体重 2.5 kg ～ 3.0 kg 的健康家兔，每只感染 800 条～ 1 000 条日本血吸虫尾蚴，饲养 60 d 后，抽取 心脏全血 ， 分离血清 ， 混合后按每支 0.1 mL 分装于微量离心管冻干 ， 作为阳性对照血清 。 阳性对照血清 检测效价不低于 1 ： 640 。 A.3 阴性对照血清 选择体重 2.5 kg ～ 3.0 kg 的健康家兔 ， 抽取心脏全血 ， 分离血清 ， 选出没有溶血的血清灭活补体 （ 56 ℃ 灭活 30 min ） ， 混合后按每支 0.1 mL 分装微量离心管冻干 ， 作为阴性对照血清 。 阴性对照血清检测效价 不高于 1 ： 5 。 A.4 稀释液 称取十二水合磷酸氢二钠 35.8 g ，氯化钠 8.5 g ，加去离子水（或蒸馏水）至 1 000 mL ，称 A 液；称 取磷酸二氢钾 6.8 g ， 氯化钠 8.5 g ， 加去离子水 （ 或蒸馏水 ） 至 1 000 mL ， 称 B 液 。 按 A 液 ： B 液为 72 ： 28 的比例混合，即为 pH 7.2 磷酸盐缓冲液。WS /T 628 — 2018 6 B B 附 录 B （资料性附录） 操作程序 B.1 操作步骤示意图 见图 B.1 。 a) 样本编号 b) 阴性、阳性对照血清稀释 c) 血凝板加稀释液 d) 待测样本稀释 e) 冻干致敏红细胞稀释和检测 图 B.1 操作步骤示意图