ICS 11.020 C 61 WS 中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准 WS /T 632 — 2018 巴贝虫检测 血涂片镜检法 Detection of Babesia spp. —— Blood smear microscopy examination method 2018 - 09 - 26 发布 2019 - 04 - 01 实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会 发 布WS/T 632 — 201 8 I 前    言 本标准按照 GB/T 1.1 — 2 009 给出的规则起草。 本标准由国家卫生标准委员会寄生虫病标准专业委员会提出。 本标准起草单位 ： 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 、 第二军医大学 、 中国农业科学院上 海兽医研究所。 本标准起草人：张仪、周晓农、刘琴、陈韶红、朱淮民、周金林。WS/T 632 — 201 8 1 巴贝虫检测 血涂片镜检法 1 范围 本标准规定了 检测巴贝虫的血涂片镜检法 。 本标准适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对巴贝虫的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 WS/T 569 疟原虫检测 血涂片镜检法 WS/T 564 巴贝虫病诊断 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 3.1 巴贝虫 Babesia spp. 一类寄生于人和脊椎动物红细胞内的原虫，可引起巴贝虫病（ B abesiosis ）。感染人体的巴贝虫有 田鼠巴贝虫 ( Babesia microti ) 、分歧巴贝虫 ( B . divergens ) 、邓肯巴贝虫 ( B . duncani ) 和猎户巴贝虫 ( B . venatorum ) 等。 3.2 血涂片 blood smears 将血液涂制于载玻片上制成的涂片 , 分为厚血膜涂片和薄血膜涂片。 4 仪器和器材 4.1 光学显微镜（ 100 × 油镜、 10 × 目镜） 4.2 血涂片染色架 4.3 血涂片干燥架 4.4 玻片盒 4.5 染色盘和染色缸WS/T 632 — 201 8 2 4.6 计数器 5 试剂和材料 5.1 吉氏染色原液（ Giemsa) 5.2 pH7.2 磷酸盐缓冲液（ PBS ） 5.3 标准级载玻片 （ 洁净载玻片，或表面带正电荷的粘附玻片 ） 5.4 甲醇 （分析纯） 5.5 香柏油或专用浸油 （折射率 ≥ 1.5 ） 5.6 二甲苯 （分析纯） 5.7 甘油 6 检测步骤 6.1 血涂片的制作 6.1.1 采血部位及取血方法 末梢 （ 无名指指尖或耳垂 ） 取血 。 用 75 ％ 酒精棉球消毒取血部位 ， 待酒精挥发后 ， 用拇指和食指紧 捏耳垂上方或无名指指尖 ， 另一只手 手 持一次性采血针迅速刺入皮肤 ， 轻轻挤压出血 。 婴儿可从拇趾或 足跟扎刺取血。 6.1.2 厚血膜制作 取 1 张已消毒的载玻片 （ 或粘附玻片 ） 作推片 ， 用推片的一角 ， 取 4 µ L ～ 5 µ L 的血量 ， 使血与另 1 张平置的载玻片 （ 或粘附玻片 ） 中央偏右的位置接触 ， 由里向外旋转 ， 画 2 圈～ 4 圈 ， 涂成直径 0.8 cm ～ 1 cm 大小圆形厚血膜（见附录 A ）。 6.1.3 薄血膜制作 干棉球抹净推片下角的血渍 ， 用同一张推片中部取约 1 µ L ~ 1.5 µ L 的血量 。 将血置于离厚血膜左边 缘约 0.3 cm 的位置 ， 推片的边缘紧贴载玻片 ， 上下轻轻移动 ， 使血沿推片的边缘散开至 2cm 宽 ， 使两 张玻片保持 25 ° ～ 35 ° 角，从右向左迅速推动推片向前，推成舌状薄血膜（见附录 A ）。 6.1.4 编号 血涂片制好后水平放置 ， 充分干燥后 ， 在玻片一侧毛玻璃上或在靠近厚血膜一端边上标注编号和日 期 。 6.2 固定与溶血 6.2.1 薄血膜固定 将薄血膜一端朝下呈 45 ° 角 ， 用一次性吸管吸取甲醇溶液 ， 均匀轻抹于薄血膜表面 ， 避免碰触厚血 膜。WS/T 632 — 201 8 3 6.2.2 厚血膜溶血 在干燥的厚血膜上滴加蒸馏水数滴 ， 完全覆盖血膜 ， 溶血数分钟 ， 待血膜呈浅灰色 ， 倾去溶血血液 。 6.3 吉氏染色 6.3.1 吉氏染液的配制 常用的吉氏染液工作液包括 2% 、 3% 、 10% 三 种浓度，分别由吉氏染液原液和 pH 7.2 磷酸盐缓冲 液（ PBS ）按比例配制， 也可购买商品化吉氏染液原液 加 实验用纯水按比例配制（见附录 B ） 。 6.3.2 吉氏染色 染色方法见附录 B 6.4 显微镜检查 在染色后的血涂片上加 1 滴香柏油或专用浸油，用 100 × （倍）油镜、 10 × （倍）目镜的光学显微 镜检查。观察血片路线顺序为薄血膜从尾部舌尖部分开始，厚血膜从上端或下端开始（见附录 A ）。 6.5 结果判定 6.5.1 巴贝虫检测阳性 血膜中发现巴贝虫判定为阳性（参见附录 C ）。 6.5.2 巴贝虫染虫率计数 6.5.2.1 薄血膜的巴贝虫染虫率计数法 显微镜下检查薄血膜，计数每个视野中的染虫红细胞和红细胞总数 2 000 个以上。用下式计算巴 贝虫染虫率。 巴贝虫染虫率 ＝ 红细胞总数 染虫红细胞 × 100 ％ 。 6.5.2. 2 厚血膜的巴贝虫染虫率计数法 若 染虫率低于 0.1 ％时 ， 显微镜下检查 整张厚血膜片 ， 计数 整张厚血膜片 的 巴贝虫虫体数 和红细胞 总数。用下式计算巴贝虫染虫率。 巴贝虫染虫率 ＝ × 100 ％ （红细胞数男性按 500 万个 / μ L 血、女性按 450 万 个 / μ L 血计算）。 WS/T 632 — 201 8 4 A 附录 A （规范性附录） 操作示意图 图 A .1 厚薄血膜血涂片的制作过程示意图WS/T 632 — 201 8 5 图 A .2 厚薄血膜血涂片的制作示意图 图 A .3 厚薄血膜血涂片的读片示意 图 AWS/T 632 — 201 8 6 B B 附录 B （规范性附录） 试剂配制与血涂片染色、保存方法 B.1 吉氏染色原液配制 将 5.0 g 吉氏粉置于研钵中，加入少量甘油充分研磨，然后边加边磨，至 250 mL 甘油加完为止 ， 倒入 500 mL 有塞深色玻璃瓶中 。 在研钵中加入少量甲醇 ， 洗掉剩余部分 ， 倒入瓶内 ， 再次加甲醇 ， 洗 后再倒入瓶中 ， 至 250 mL 甲醇洗净研钵中甘油为止 。 置室温内 ， 避免阳光直射 。 塞紧瓶塞 ， 避免蒸发 和高湿造成的氧化 。每天用力摇动溶液 5 min ， 3 d 后即可使用， 储存时间越久染色效果越佳。根据日 常的需求，用干燥吸管吸取少量的染色原液到密闭的分装瓶中（大约 25 mL ） 。切勿向原液中加入水 。 B.2 pH 7.2 磷酸盐缓冲液（ PBS ）的配制 称量 8.0 g NaCl ， 0.2 g KCl ， 0.24 g KH 2 PO4 （ 或者 1.44g Na 2 HPO4 ） 和 1.8 g K 2 HPO4 ， 溶 于 800 ml 蒸馏水中 ， 用 HCl 调节溶液的 pH 值至 7.2 ， 最后加蒸馏水定容至 1 L 。 保存于 4 ℃ 冰箱中备用 。 B.3 吉氏染色工作液配制 B.3.1 2 ％ 吉氏染液工作液的配制 在 98 mL pH 7.2 磷酸盐缓冲液中加入 2 mL 吉氏染色原液并混匀，或 98 mL 实验用纯水中加入 2 mL 商品吉氏染色原液并混匀。 B.3.2 3 ％吉氏染液工作液的配制 在 9 7 mL pH 7.2 磷酸盐缓冲液中加入 3 mL 吉氏染色原液并混匀，或 9 7 mL 实验用纯水中加入 3 mL 商品吉氏染液原液并混匀。 B.3.3 10 ％吉氏染液工作液的配制 在 9 0 mL pH 7.2 磷酸盐缓冲液中加入 10 mL 吉氏染色原液并混匀，或 9 0 mL 实验用纯水中加入 10 mL 商品吉氏染液原液并混匀。 B.3.4 注意事项 吸取吉氏染色原液时切勿摇晃盛染色原液瓶子 。 吉氏染色工作液应现用现配 ， 切勿将未用完的吉氏 染色工作液倒回原液瓶中。 B.4 单张血涂片染色法 单张血涂片吉氏染色常用于临床巴贝虫病患者的巴贝虫显微镜检测。采用 3 ％吉氏染液染色 30 min 或更长时间 。 该染色法染色的血涂片可长期保存 。 也可采用 10 ％吉氏染液染色 8 min ～ 10 min ， 但 该染色法染色的血涂片不适合长期保存。 B.4.1 3 ％吉氏染液染色法