ICS 11.020 C 61 WS 中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准 WS /T 633 — 2018 巴贝虫检测 虫种核酸鉴定法 Detection of Babesia spp. —— Identification of species by nucleic acid method 2018 - 09 - 26 发布 2019 - 04 - 01 实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会 发 布WS/T 633 — 2018 I 前    言 本标准按照 GB/T 1.1 — 2009 给出的规则起草。 本标准由国家卫生标准委员会寄生虫病标准专业委员会提出。 本标准起草单位：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、复旦大学、第二军医大学。 本标准起草人：刘琴、周晓农、张仪、胡薇、陈家旭、朱淮民。WS/T 633 — 2018 1 巴贝虫检测 虫种核酸鉴定法 1 范围 本标准规定了 检测 巴贝虫的 虫种核酸鉴定法 。 本标准适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对巴贝虫的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 WS/T 564 巴贝虫病诊断 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 巴贝 虫 Babesia spp. 一类寄生于人和脊椎动物红细胞内的原虫，可引起巴贝虫病（ b abesiosis ）。感染人体的巴贝虫种 类主要有田鼠巴贝虫 ( Babesia microti ) 、 分歧巴贝虫 （ B. divergens ） 、 邓肯巴贝虫 （ B. duncani ） 和猎户 巴贝虫（ B. venatorum ）等（参见附录 A ）。 4 仪器和器材 4.1 高速离心机 最大相对离心力为 12 000 × g 。 4.2 涡旋仪 无级调速范围为 200 r/min ～ 3 000 r/min 。 4.3 PCR 扩增仪 温度范围为 4 ℃ ～ 99 ℃ ， 温度精确为 0.1 ℃ ， 热盖为 105 ℃ 。 4.4 微波炉 4.5 电泳仪 电压为 5 V ～ 5 000 V ，电流为 1 mA ～ 500 mA 。WS/T 633 — 2018 2 4.6 凝胶成像系统 镜头分辨率 (H × V) 为 1 360 × 1 024 ，光源为透射 UV 。 5 试剂和材料 5.1 分子生物学试剂 Taq 酶、 脱氧核糖核苷三磷酸（ dNTPs ） 、分子 质 量指示物及核酸提取试剂盒选用商品化 产品 。 5.2 化学试剂 Tris- 乙酸电泳缓冲液（ TAE ）、琼脂糖凝胶、 6 × 加样缓冲液（参见附录 B ）。 5.3 引物 扩增巴贝虫 18S 核糖体 RNA （ 18S rRNA ） 基因和转录间隔区 （ ITS ） 基因的特异性引物 （ 见附录 C ）。 5.4 参照材料 阳性对照为田鼠巴贝虫 peabody mjr 株基因组 DNA 。 空白对照为 去离子灭 菌水。 阴性对照为健康人全血基因组 DNA 。 6 检测步骤 6.1 样品 样品为临床诊断或疑似巴贝虫 病 病例抗凝血样品。 6.2 虫种核酸鉴定 6.2.1 核酸提取 基因组 DNA 提取采用商品化全血 DNA 提取试剂盒（参见附录 B ）。 6.2.2 18S rRNA 基因扩增 见附录 C 。 6.2.3 ITS 基因扩增 见附录 C 。 6.2.4 结果判定 6.2.4.1 电泳分析 6.2.4.1.1 电泳WS/T 633 — 2018 3 取第二轮 PCR 产物 5 µ L 与 1 μ L 6 × 加样缓冲液混合 ， 加样于含溴化乙锭替代物的 1.0 ％琼脂糖凝胶 中，在 1 × TAE 缓冲液中， 5 V/cm 电泳约 40 min ，当溴酚蓝到达底部时停止电泳，用凝胶成像系统或 紫外分析仪分析。 6.2.4.1.2 PCR 结果判断 6.2.4.1.2.1 PCR 扩增巴贝虫 18S rRNA 基因，出现大小为 400 bp 左右特异性的扩增片段，空白对 照和阴性对照未出现条带 ， PCR 结果阳性 。 PCR 扩增巴贝虫 18S rRNA 基因 ， 未出现大小为 400 bp 左 右特异性的扩增片段，空白对照和阴性对照未出现条带， PCR 结果阴性。 6.2.4.1.2.2 PCR 扩增巴贝虫 ITS 基因，出现大小在 700 bp ～ 2 100 bp 的特异性的扩增片段，空白对 照和阴性对照未出现条带， PCR 结果阳性。 PCR 扩增巴贝虫 ITS 基因，未出现特异性的扩增片段，空 白对照和阴性对照未出现条带， PCR 结果阴性。 6.2.4.2 测序分析 阳性 PCR 扩增产物进行双向测序，将序列进行 BLAST 比对分析（见附录 C ）。 6.2.4.3 虫种鉴定 根据 PCR 扩增产物电泳结果与测序结果分析，综合判定虫种种类（见附录 C ）。WS/T 633 — 2018 4 A A 附 录 A （资料性附录） 病原生物学 A.1 分类 巴贝虫（ Babesia spp. ）属于顶复门（ Apicomplexa ）、孢子虫纲（ Sporozoa ）、梨形虫亚纲 （ Piroplasmasina ） 、 梨形虫目 （ Piroplasmida ） 、 巴贝虫科 （ Babesiidae ） 的巴贝虫属 （ Babesia ） 。 目前 已鉴定的有 100 多种巴贝虫 ， 可以感染牛 、 马 、 羊 、 犬等多种哺乳动物和鸟类 。 在 100 多种巴贝虫中 ， 既 往已知可以感染人的巴贝虫种类主要有 ： 田鼠巴贝虫 ( B. microti ) 、 分歧巴贝虫 （ B. divergens ） 、 邓肯巴 贝虫 （ B. duncani ， 也称为 WA1 ） 和猎户巴贝虫 （ B. venatorum ， 也被称为 EU1 ） 等 。 不同巴贝虫虫种引 起人体临床症状的比较见表 A.1 。 A.2 分布 本病呈地方性流行。 在美国，巴贝虫 病 病例主要发现于马萨诸赛岛、纽约州、康涅狄格岛、加利福尼亚州以及罗得岛 。 在欧洲，法国、葡萄牙、意大利、波兰、挪威等地均有人巴贝虫 病 病例发生。另外，在埃及、墨西哥 、 澳大利亚、日本、韩国、巴基斯坦及南非也均有人巴贝虫病 病例 报道。 在我国云南 、 河南 、 新疆 、 山东 、 陕西 、 浙江 、 江苏 、 广西 、 福建及台湾 、 香港地区等地均有人巴 贝虫病 病例 报道。 表 A.1 不同巴贝虫虫种引起人体临床症状的比较 虫种 地理分布 媒介名称 潜伏期 临床特征 其他 田鼠巴贝虫 （ B. microti ） 欧洲 、 美国 、 日本 、 中国 、 埃及等 肩突硬蜱、 卵形硬蜱、 全沟硬蜱、 丹敏硬蜱 1 周 ~ 6 周，甚至 3 个月以上 大多数患者症状比较轻微 ， 只出现一过 性的发热症状 ； 而重症患者出现疟疾样 症状 ， 包括发热 、 寒战 、 肌肉疼痛 、 贫 血、无力、肝脾肿大 、 溶血性贫血等 一般以 50 岁以上 的老人易感 分歧巴贝虫 （ B. divergens ） 欧洲 篦子硬蜱 1 周 ~ 3 周 突然起病 、 血红蛋白尿 、 黄疸 、 休克样 表现 脾脏切除和免疫 缺陷者易感 邓肯巴贝虫 （ B. duncani ） 欧洲、美国 等 丹敏硬蜱、 肩突硬蜱 3 周 ~ 2 个月 发热、寒战、肌肉疼痛、贫血、无力 、 肝脾肿大 、 溶血性贫血 ， 持续数周或更 长 脾脏切除患者易 感；易输血传播 猎户巴贝虫 （ B. venatorum ） 欧洲、中国 等 蓖子硬蜱、 卵形硬蜱 不明确 大多数患者症状比较轻微 ， 只出现一过 性的发热症状 ； 严重者表现贫血 、 血红 蛋白尿、黄疸等症状 免疫功能低下者 或者脾切除患者 易感WS/T 633 — 2018 5 B B 附 录 B （资料性附录） 试剂配制 B.1 试剂的配制 B.1.1 Tris- 乙酸电泳缓冲液（ Tris- acetic acid buffer solution ， TAE ）的配制 50 × TAE 的配制 ： 三 （ 羟甲基 ） 氨基甲烷 （ Tris 碱 ） 242 g ， 冰乙酸 57.1 mL ， 0.5 mol/L EDTA( pH 8.0) 100 mL ，加 去离子灭菌 水定容至 1 000 mL ，混匀 4 ℃ 保存备用。 B.1.2 1 × TAE 使用液的配制 50 × TAE 20 mL 加蒸馏水定容至 1 000 mL ，混匀备用。 B.1.3 1.0% 琼脂糖凝胶的配制 琼脂糖 1.0 g 加 1 × TAE 定容至 100 mL ，微波炉加热完全融化后，溶液冷却至 60 ℃ ，加 10 mg/mL 溴化乙锭替代物 5 µ L （终浓度 0.5 µ g/mL) ，轻轻混匀后，制备凝胶。 B.1.4 6 × 加样缓冲液的配制 溴酚蓝 0.25 g ，蔗糖 40 g ，加蒸馏水至 100 mL 。置于 4 ℃ 保存备用。 B.2 DNA 的提取 取 100 µ L 血液样品 ， 用商品化的全血样品 DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA ， 操作步骤按试剂盒说 明书进行。WS/T 633 — 2018 6 C C 附 录 C （规范性附录） PCR 实验、测序结果分析及标准参考序列 C.1 PCR 扩增引物序列 巴贝虫虫种鉴定引物见表 C.1 。 表 C.1 巴贝虫虫种鉴定引物 引物 引物名称 引物序列 a