ICS 11.020 C 61 WS 中 华 人 民 共 和 国 卫生行 业 标 准 WS/T 635—2018 尿中砷形态测定 液相色谱 -原子荧光法 Determination of urinary arsenic speciation — liquid chromatography -atomic fluo rescence spectrometry 2018 - 09 - 17发布 2019 - 03 - 01实施 中华人民共和国 国家卫生 健康委员会 发布 WS/T 635—2018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 —2009给出的规则起草。 本标准起草单位： 北京市疾病预防控制中心 、 重庆市疾病预防控制中心、 广东省疾病预防控制中心、 安徽省疾病预防控制中心、北京朝阳医院、山西省疾病预防控制中心 。 本标准主要起草人： 刘丽萍、王小艳、张妮娜、 张洁、王晶、韦 莹、李惠玲、郭舒岗、陈绍占、 戴 锐睿。WS/T 635—2018 1 尿中砷形态测定 液相色谱 -原子荧光法 1 范围 本标准规定了 测定尿中砷形态 （亚砷酸盐 [As（III）]、砷酸盐 [As（V）]、一甲基砷（ MMA）和二 甲基砷（ DMA））的液相色谱 -原子荧光法 。 本标准适用于 尿中砷形态（亚砷酸盐 [As（III）]、砷酸盐 [As（V）]、一甲基砷（ MMA）和二甲基 砷（ DMA））的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 尿样按一定比例稀释后，以液相色谱进行分离，分离后的目标化合物在酸性介质下与硼氢化钾 （KBH 4）反应，生成气态砷化合物，用原子荧光光谱仪进行测定，保留时间定性，以峰高或者峰面积 绘制标准曲线法定量。 4 仪器 4.1 玻璃器皿均需以硝酸溶液（ 1+4）浸泡 24 h，用水反复冲洗，最后用 纯水冲洗干净 。 4.2 液相色谱 —原子荧光光谱联用仪。 4.3 pH计（精度 0.01）。 4.4 电子天平（感量 0.1 mg）。 4.5 超声波清洗器 。 4.6 离心机，转速 ≥8000 r/min。 4.7 纯水制备仪 。 5 试剂 WS/T 635—2018 2 5.1 实验用水及试剂要求 ：除非另有说明， 本方法所用试剂均为优级纯， 纯水为 GB/T 6682 规定的一级 水。 5.2盐酸（ HCl，ρ=1.19 g/mL ）。 5.3 氢氧化钾 （KOH）。 5.4 硼氢化钾 （KBH 4）。 5.5 磷酸氢二铵 [(NH 4)2HPO 4]。 5.6 甲酸（ HCOOH，99 %）。 5.7 标准物质：亚砷酸根 （AsO33-），砷酸根（ AsO43-），一甲基砷（ CH 4AsO 3-），二甲基砷（ C2H6AsO2-） 均为有证标准物质。 6 试剂配制 6.1 载流，盐酸溶液（ 7+93） 量取 70 mL盐酸，用纯水稀释至 1000 mL。 6.2 还原剂（ 20 g/L 硼氢化钾 溶液-3.5 g/L氢氧化钾 溶液） 称取 3.5 g氢氧化钾溶解于 900 mL纯水中混匀，加入 20 g硼氢化钾，用纯水稀释至 1000 mL，混 匀。 6.3 甲酸溶液 （10+90） 量取 10 mL甲酸用纯水稀释至 100 mL。 6.4 流动相（ 15 mmol/L 磷酸氢二铵 溶液） 称取 1.98 g的磷酸氢二铵溶解于 1000 mL 纯水中，用 甲酸溶液 （10+90）调节 pH至6.0，超声脱气 5 min，备用。 6.5 砷形态标准溶液配制 6.5.1 砷形态标准储备溶液 [ρ(As)=10.0 mg/L ]：分别准确称取适量亚砷酸根 、砷酸根、一甲基砷 、二甲 基砷四种砷形态标准物质，用纯水配制成含砷浓度为 10.0 mg/L 的砷形态单标标准储备溶液，置于 4 ℃ 冰箱中保存。 6.5.2 砷形态混合标准溶液 [ρ(As)=1.0 mg/L ]： 分别准确移取 10.0 mg/L 的四种砷形态单标标准储备溶液 1.00 mL置于 10 mL容量瓶中，用纯水定容至刻度，现用现配。 WS/T 635—2018 3 6.5.3 砷形态混合标准使用系列溶液 [ρ(As)=0～100.0 µ g/L] ：分别准确移取一定量的 1.0 mg/L 砷形态混 合标准溶液，用纯水逐级稀释成 0.0 µ g/L、2.0 µ g/L、5.0 µ g/L、10.0 µ g/L 、50.0 µ g/L 、100.0 µ g/L 四种 砷形态混合标准系列使用溶液，现用现配。 7 样品收集、运输和保存 收集不少于 10 mL尿液，置于洁净的聚丙烯塑料或玻璃试管中，严密封口以防蒸发。现场收集尿 样后，在 4 ℃下保存运输；样品应该尽快测定，在 4 ℃下可保存 30 d。 8 分析步骤 8.1 试样的前处理 取1mL均匀的尿样用纯水稀释 3倍，用 0.45 µm水系滤膜过滤后上机测定。如果尿样中有沉淀， 先将尿样离心 10 min（8000 r/min ），取一定量的上清液按以上方法测定。如果样品中 砷形态浓度超过 标准曲线上限，则将尿样按一定比例 稀释后测定。 8.2 液相色谱参考条件 8.2.1 色谱柱条件：阴离子交换色谱柱（柱长 250 mm，内径 4.1 mm），或等效柱。阴离子交换色谱保 护柱（柱长 25 mm，内径 2.3 mm），或等效柱。 8.2.2 流动相组成： 15 mmol/L 磷酸氢二铵 溶液（pH=6.0）作为流动相， 1.0 mL/min流速洗脱，进样体 积为 100 µL。 8.3 原子荧光检测参考条件 原子荧光检测参考条件如下： ——光电倍增管负高压： 280 V； ——砷空心阴极灯总电流： 90 mA； ——辅阴极灯电流： 40 mA； ——原子化方式：火焰原子化； ——原子化器温度：中温； ——氩载气流量： 300 mL/min ； ——氩屏蔽气流量： 600 mL/min ； ——还原剂： 20 g/L 硼氢化钾 溶液-3.5 g/L氢氧化钾 溶液； WS/T 635—2018 4 ——载流：盐酸溶液 （7+93）。 8.4 标准曲线的测定 分别吸取 100 µL四种砷形态的混合标准使用系列溶液，依次注入液相色谱 -原子荧光光谱联 用仪进 行分离及检测，得到色谱图，以保留时间定性。以标准系列溶液中 砷形态的浓度为横坐标，以色谱峰高 或峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。标准溶液色谱图见附录 A中图 A.1。 8.5 试样溶液的测定 吸取 100 µL试样溶液注入液相 色谱—原子荧光光谱联用仪进行分析，得到色谱图，以保留时间定 性。根据标准曲线得到试样溶液中砷形态的含量。试样溶液色谱图见图 A.2。 9 分析结果的计算 尿样中砷形态 [As（III）、As(V)、MMA、DMA ]的含量（以砷计）按式（ 1）计算 : Xi =（Ci - C0）·K ………………………（ 1） 式中： Xi——尿样中砷 形态的含量 （以砷计），单位为微克 每升（ µg/L）； Ci——由标准曲线查得的试样溶液中砷 形态的浓度（以砷计），单位为微克每升（ µg/L）； C0——由标准曲线查得的现场空白中砷形态的浓度（以砷计） ，单位为微克每升（ µ g/L）； K— —尿样稀释倍数 。 10 方法特性 10.1 检出限 本方法中亚 砷酸盐、一甲基砷、二甲基砷 检出限均为 0.5 µg/L，定量限为1.5 µ g/L；砷酸盐检出限 为0.8 µg/L，定量限为2.4 µ g/L。 10.2 精密度 6个实验室对含 砷形态为 6.0 μg/L～400.0 μg/L的尿样进行 6次重复测定， 相对标准偏差 均小于 5.0%。 10.3 准确度 采用尿中砷形态成分 标准物质及加标回收考察方法准确性， 6个实验室测定的不同浓度的样品加标回 收率在 80%～120%之间。 WS/T 635—2018 5 11 质量保证和质量控制要点 11.1 实验环境、器皿、试剂、采样及运输过程应避免砷污染。 11.2 每次样品测定时均应配制和测定标准系列，标准曲线回归方程的相关系数绝对值应 ≥0.998。 11.3 推荐采用平行样品、冻干 人尿中砷形态成分 标准物质及加标回收 作为质量控制手段。 11.4 随样品采集同时进行空白采集 。 WS/T 635—2018 6 附 录 A （资料性附录） 砷形态标准溶液及试 样溶液色谱图 A.1 砷形态标准溶液色谱图 10 µ g/L 亚砷酸 [As（III）]，二甲基砷（ DMA） ，一甲基砷（ MMA） ，砷酸 [As（V）]标准溶液色谱 图，见图 A.1。 图A.1 砷形态标准溶液（ 10 µg/L）色谱图 A.2