ICS 11.020 C 55 WS 中 华 人 民 共 和 国 卫生行 业 标 准 WS/T 677—2020 人群维生素 D缺乏筛查方法 Method for vitamin D deficiency screening 2020-05-06发布 2020-11-01实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会 发布 WS/T 677—2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 —2009 给出的规则起草。 本标准起草单位：中国疾病预防控制中心营养与健康所、宁波市疾病预防控制中心、深圳市慢性病 防治中心、深圳市计量质量检测研究院、南京医科大学、中粮营养健康研究院。 本标准主要起草人：杨丽琛、杨晓光、胡贻椿、金米聪、杨国武、周继昌、汪之顼、贾健斌、王俊、 陈晓红、张协光、莫俊銮、毛德倩、付志成、王 睿、丁叶、周明、陈竞、张森。 WS/T 677—2020 1 人群维生素 D缺乏筛查方法 1 范围 本标准规定了人群维生素 D缺乏和不足筛查的指标、参考判定值和检测方法。 本标准适用于人群维生素 D营养状况的判定 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅 注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 WS/T 225 临床化学检验血液标本的收集与处理 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 25-羟基维生素 D 25-hydroxyvitamin D ；25(OH)D 血液中维生素 D的主要循环形式，稳定性好，是公认的评价人体维生素 D营养状况的可靠指标，主 要包括两种形式： 25(OH)D 2、25(OH)D 3，其中25(OH)D 3是血液中维生素 D的主要存在形式。 3.2 维生素D缺乏 vitamin D deficiency 当人体血清（或血浆） 25-羟基维生素 D含量低于缺乏的参考判定值时，可判定为维生素 D缺乏。 3.3 维生素D不足 vitamin D insuffi ciency 当人体血清（或血浆） 25-羟基维生素 D含量低于正常人群的参考判定值，但高于缺乏参考判定值 时，可判定为维生素 D不足。 4 人群维生素 D营养状况判定指标及参考判定值 人群维生素 D营养状况判定指标及参考判定值见表 1。 WS/T 677—2020 2 表1 人群维生素 D营养状况判定指标及参考判定值 判定指标 正常 不足 缺乏 血清（或血浆） 25-羟基维生素 D含量 ng/mL nmol/L ng/mL nmol/L ng/mL nmol/L ≥20 ≥50 ≥12～＜20 ≥30～＜50 ＜12 ＜30 5 测定方法 5.1 血液标本的采 集与保存 按附录A规定的方法进行。 5.2 第一法：液相色谱串联质谱法 按附录B规定的方法进行。 5.3 第二法：化学发光免疫法 按附录C规定的方法进行。 5.4 第三法：酶联免疫法 按附录D规定的方法进行。 WS/T 677—2020 3 A A 附 录 A （规范性附录） 血液标本的采集与保存 A.1 标本采集 A.1.1血液标本的采集：空腹静脉血，取血方法依据 WS/T 225 以及检测方法 的要求采集空腹静脉血 1 mL。 A.1.2采血管： 根据所需血清或血浆，使用不同采血管分装。 A.2 血清、血浆保存 标本于2 ℃～8 ℃可稳定 7 d，-20 ℃可稳定 12个月。若标本不能及时检测 ，建议适量分装后于 -70 ℃以下存放标本，仅一次冻融。 WS/T 677—2020 4 B B 附 录 B （规范性附录） 液相色谱串联质谱法 B.1 原理 血清（血浆）中的 25(OH)D 2和25(OH)D 3经甲醇/乙腈沉淀蛋白，采用正己烷萃取，氮气吹干 ，用初始 流动相复溶，使用液相色谱 法分离，串联质谱多反应监测模式（ MRM）检测，同位素内标法定量，该方 法可以分别测定 25(OH)D 2和25(OH)D 3。 B.2 试剂和溶液 除非另有说明，本方法所有试剂均为分析纯，水符合 GB/T 6682 中一级用水规定，溶液按照 GB/T 603 配制。 B.2.1 试剂 B.2.1.1 25(OH)D 2标准品（C28H44O2，CAS：21343-40-8）：纯度＞98%或有证标准物质 。 B.2.1.2 25(OH)D 3标准品（ C27H44O2，CAS：19356-17-3）：纯度 ＞98%或有证标准物质 。 B.2.1.3 同位素内标 [2H3]-25(OH)D 2标准品（ C28H412H3O2，CAS：1217467-39-4）：纯度 ＞98%。 B.2.1.4 同位素内标 [2H3]-25(OH)D 3标准品（ C27H412H3O2，CAS：140710-94-7）：纯度 ＞98%。 B.2.1.5 甲醇（CH3OH）：色谱纯。 B.2.1.6 正己烷（ C6H14）：色谱纯。 B.2.1.7 甲酸（HCOOH）：色谱纯。 B.2.1.8 牛血清白蛋白 （BSA）：纯度≥98%。 B.2.1.9 氮气（N2）：纯度 ≥99.9%。 B.2.1.10 甲酸-水溶液： 0.1%。 B.2.1.11 甲酸-甲醇溶液： 0.1%。 B.2.1.12 乙腈（CH3CN）：色谱纯。 B.2.1.13 BSA牛血清白蛋白水溶液： 1%。 B.2.1.14 沉淀剂：甲醇+乙腈（1+1）。 B.2.1.15 标准储备溶液（ 10 μg/mL）：分别称 取25(OH)D 2和25(OH)D 3标准品1 mg（精确至 0.01 mg）于 2个100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。此溶液 中25(OH)D 2和25(OH)D 3的浓度为10 μg/mL。溶 液转移至试剂瓶中后， -20 ℃下避光保存，备用。 B.2.1.16 同位素内标标准储备溶液（ 10 μg/mL）：分别称取同位素内标 [2H3]-25(OH)D 2和[2H3]-25(OH)D 3 1 mg（精确至 0.01 mg）于2个100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。此溶液 中[2H3]-25(OH)D 2和 [2H3]-25(OH)D 3的浓度为10 μg/mL。溶液转移至试剂瓶中后， -20 ℃下避光保存，备用。 B.2.1.17 标准系列溶液：分别 准确移取 25(OH)D 2（10 μg/mL）和25(OH)D 3（10 μg/mL）5 μL、10 μL、 25 μL、50μL、125 μL、250 μL和500 μL于7个10 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度。此系列溶液 的25(OH)D 2和25(OH)D 3的浓度为 5 ng/mL、10 ng/mL 、25 ng/mL 、50 ng/mL 、125 ng/mL 、250 ng/mL和500 ng/mL。 B.2.1.18 混合同位素内标溶液（ 100 ng/mL ）：分别 准确吸取同位素内标 [2H3]-25(OH)D 2储备溶液（ 10 WS/T 677—2020 5 μg/mL）和[2H3]-25(OH)D 3储备溶液（ 10 μg/mL）各100 μL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度。 此溶液的同位素内标 [2H3]-25(OH)D 2和[2H3]-25(OH)D 3的浓度均为 100 ng/mL 。溶液转移至试剂瓶中后， -20℃下避光保存，备用 。 B.2.2 仪器和设备 B.2.2.1 分析天平，感量： 0.0001 g。 B.2.2.2 分析天平，感量： 0.00001 g。 B.2.2.3 液相色谱 -串联质谱联用仪。 B.2.2.4 氮吹仪或真空离心干燥仪 。 B.2.2.5 离心机：离心力 ≥12000 ×g。 B.2.2.6 旋涡混合器。 B.2.2.7 移液枪或移液器。 B.3 分析步骤 B.3.1 样品制备 取血清（血浆）样品 200 μL至2 mL离心管中 ，加入20μL混合同位素内标溶液，涡旋振荡 30 s。加 入400 μL沉淀剂（ 甲醇+乙腈，1+1），室温下涡旋振荡混匀 30 s；加入1.2 mL正己烷，室温下涡旋振荡 5 min，然后在 4 ℃和离心力大 于12000 ×g下离心5 min；吸取1.0 mL上清液至 1.5 mL离心管中，室温下 用氮气吹 至干；用 100 μL初始流动相复溶，涡旋振荡 30 s，4 ℃和离心力大于 12000×g下离心5 min， 上清液转移至进样瓶中待 LC-MS/MS分析。 B.3.2 标准工作溶液制备 取7个2 mL离心管，分别加入 180 μL空白替代血清样品（ 1%BSA牛血清白蛋白水溶液），以及 20 μL 标准系列溶液（ B.2.1）和20 μL混合同位素内标溶液， 此系列相当于 0.5 ng/mL～50 ng/mL浓度范围。 旋涡振荡 30 s。以下操作同 B.3.1。 B.3.3 液相色谱 -串联质谱联用仪参数设置 B.3.3.1 液相色